分子生物学第五章.ppt

用于沉淀核酸的盐溶液暂态表达(Transientexpression)表达载体转染动物细胞后，表达载体以附加体(episome)形式存在于细胞核中。表达载体上的目的基因在24-72小时内表达，并随着附加体的消失而最终消失。稳定表达(Stableexpression)用选择培养基筛选转染的动物细胞而获得稳定细胞系，表达载体上的目的基因整合到细胞的基因组DNA中。稳定细胞系可以持续表达目的基因。病毒载体介导的基因治疗过程利用病毒载体将目的基因导入靶细胞，使目的基因的产物补偿或替代有缺陷基因的功能。造血细胞、淋巴细胞、肝细胞、血管内皮细胞、皮肤成纤维细胞等可作为靶细胞限制性内切酶和修饰酶(Restrictionendonucleasesandmodifyingenzymes)一类存在于细菌中的核酸内切酶，它们识别双链DNA分子上特异的核苷酸序列，并对DNA分子进行剪切。限制性：细菌的DNA甲基化酶可对限制性内切酶识别序列中的碱基进行甲基化修饰，因此，细菌DNA不被限制性内切酶剪切，而外源DNA分子被限制性内切酶所剪切。内切酶：是指酶切位点在DNA分子内，而不是两端。限制性内切酶(一)限制性内切酶的分类回文结构(palindrome)是双链DNA分子中的反向重复结构，即每条链从5’?3’方向读其核苷酸序列都相同。 5’GGATCC3’ 3’CCTAGG5’ 5’AGATCT3’ 3’TCTAGA5’ 5’CCCGGG3’ 3’GGGCCC5’1.命名属名(genus)的第一个字母，用大写表示；种名(species)的前两个字母，用小写表示；细菌株名(strain)，用大写或小写表示；同一细菌株中不同的限制性内切酶被发现和分离的顺序，用罗马字表示。(二)类型II限制性内切酶EcoRIE=Escherichia属co=coli种R=RY13株I=第1个被分离的限制性内切酶2.识别序列(1)具有回文结构 BamHI 5’GGATCC3’ 3’CCTAGG5’ KpnI 5’GGTACC3’ 3’CCATGG5’(2)具有间断的回文结构 HinfI(XmnI) 5’GANTC3’ 3’CTNAG5’(3)具有简并性碱基 HincII 5’GT(T/C)(A/G)AC3’ 3’CA(A/G)(T/C)TG5’(4)无回文结构 MboII 5’GAAGA(N)83’ 3’CTTCT(N)75’酶切位点识别序列(回文结构)DNA片段1DNA片段23.经限制性内切酶酶切后所产生的末端类型(1)粘性末端(stickyends,cohesiveends)5’凸端粘性末端EcoRI3’凸端粘性末端(2)平端或钝端(bluntends)异源同工酶(Isoschizomer)来源于不同细菌但具有相同识别序列的限制性内切酶为异源同工酶。识别序列和酶切位点均相同的限制性内切酶 识别序列相同但酶切位点不同的限制性内切酶酶活性单位 在37?C(某些限制性内切酶在25?C或50?C)条件下，每小时酶切1?gDNA所用的酶量为１个单位(Unit)。限制性内切酶缓冲液 NaCl,KCl:提供正确的离子强度 Tris-HCl:提供合适的pH环境 Mg2+:限制性内切酶的辅助因子 DTT:还原剂 BSA:保护限制性内切酶5.类型II限制性内切酶的反应条件T4DNA连接酶(T4DNAligase)碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase)DNA聚合酶I大片段(Klenow)T4DNA聚合酶(T4DNApolymerase)T7DNA聚合酶(T7DNApolymerase)TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)逆转录酶(Reversetranscriptase)末端脱氧多核苷酸转移酶(Terminaldeoxynucleotidyltransferase)多核苷酸激酶(Polynucleotidekinase)