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PCR原理及其应用

姓名：曹宇

学号：20104032303

班级：动物医学(3)班

摘要：聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是体外扩增DNA序列的技术。它

与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物学的实验工作的基础。在这

三种实验技术中，PCR方法理论上出现最早，实践中应用也最广泛。PCR技术使微量的核

酸(DNA或RNA)操作变得简单易行，同时还可使核酸研究脱离于活体生物。PCR技术

的发明是分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。

关键词：聚合酶链式反应

一

PCR发展简史

核酸研究已有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初人们致力于研究基因的体

外分离技术，但由于核酸的含量较少，在一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于

1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚

合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因”。但由于当时基因序列分析方法尚

未成熟，热稳定的DNA聚合酶尚未报道，以及寡聚核苷酸引物合成还处在手工及半自动合

成阶段，这种想法似乎没有实际意义。

1983年的一天，美国科学家KaryMullis驱车在蜿蜒的州际高速公路上行驶中，孕育出

了PCR技术的原型。经过两年的努力，他在实验上证实了PCR的构想，并于1985年申请

了有关PCR的第一个专利，在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文。从此PCR技

术得到了生命科学界的普遍认同，KaryMullis也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。但

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，这虽然较传统

的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，

会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不

少困难。这使得PCR技术在当时成了一种笨拙的中看不中用的实验室方法。

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真

实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(Thermusaquaticus)中提取到一种

耐热DNA聚合酶。此酶耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶，

从而极大地提高了PCR扩增的效率。为与大肠杆菌聚合酶IKlenow片段区别，将此酶命

名为TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)。此酶的发现使PCR方法得到了广泛的应

用，也使PCR成为遗传与分子分析的根本性基石。

在以后的十多年里，PCR方法不断地被改进。例如，应用具有3’一5’修复活性的热

稳

定DNA聚合酶代替不具37—57修复活性的TaqDNA聚合酶，减少了在扩增过程中产生

的

错误配对，大大提高了在复制过程中的真实性。原来的PCR只能扩增两段已知序列之间的

DNA，现在可以扩增到已知序列两侧的未知序列[11，甚至可以扩增到序列未知的新基因[2l。

PCR的樟梅托从原桌兽用的DNA发展到直接用RNA作为模板，即反转录PCR，这就使得

无目的基因存在，现在已经可以用来定量测定[3]，即回答样品中原始模板的确切数目。

PCR扩增的片段也从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片

段[4|。PCR也从单纯用来扩增基因到能将两个以上的基因连接起来，省去了限制性内切酶

消化和用连接酶连接的步骤，这就是所谓的克隆PCRE5]。再加上PCR方法与其他方法联合

应用，到目前为止已报道的PCR方法有几十种之多。

总之，自PCR方法建立以来，在20多年的时间里发展很快，已有一系列PCR方法被

设计出来，并广泛应用于遗传学、微生物学乃至整个生命科