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基于基因条形码的鱼类物种鉴定技术要求
1范围
本文件规定了鱼类基因条形码鉴定中的样品处理、基因扩增、序列分析、比对鉴定及结果判定等操作程序和规范。
本文件适用于对自然环境种化产生的野生型鱼类或其残存的组织进行物种鉴定,不适用于杂交品种。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
FDASOPforGeneratingDNABarcodesSuitableforSpeciesIdentificationofanUnknownFishTissueSample
3术语与定义
下列术语与定义适合于本文件。
3.1
基因条形码（DNAbarcoding）
是指可用于物种鉴定的具有生物物种序列特征的DNA片段，本文件中指鱼类线粒体基因组中的COI基因片段。
3.2
基因条形码鉴定技术（DNAbarcodingidentificationtechnique）
一种利用基因片段进行生物物种鉴定和系统进化关系研究的技术，建立在基因扩增和序列比对的基础之上，它具有不受物种发育状态、雌雄性个体及形态特征完整性与否的限制、减少对分类专家的依赖、不受主观因素影响、准确率高、借助互联网可以实现数据共享等特点。
3.3
空白对照（Blankcontrol）
从基因组DNA提取步骤开始至PCR扩增和PCR产物检测整个过程，没有加入任何鱼源性成分的空白的灭菌洁净离心管，与其他受试的样品平行进行操作以观察实验是否处于正常状态。空白对照没有PCR产物条带产生。
3.4
阳性对照（Positivecontrol）
2
在PCR扩增过程中，与受试样品平行进行的对照反应，以在正常反应情况下一定能产生PCR产物的DNA为反应模板，用于观察整个反应体系和反应过程是否正常，阳性对照应有PCR产物带产生。
3.5
阴性对照（Negativecontrol）
非鱼类样品的其他物种样品，与受试样品平行进行的对照反应，用于观察整个反应体系是否正常，确认没有受到污染，阴性对照没有PCR产物条带产生。
3.6
序列相似度（Similarityofthesequences）
反映序列间相似程度的数值，一般以百分数表示。
3.7
FASTA格式(FASTAformat)
生物信息学术语，又称Pearson格式，是一种用文本表示核苷酸序列或者氨基酸序列的格式。核苷酸或者氨基酸碱基用单个字母表示，序列的第一行一般用“＞”起始，随后可以添加序列名或者注释，第二行为序列本身，只允许使用既定的核苷酸或者氨基酸编码符号，如核苷酸使用ATCG表示，序列中不能出现回车等字符。
示例1:
1
GTGTGTGGGTATGATTCTAAACTGACAAATCGCGCCTATTTATACTTTTTCCCCGGGGTTTAAAT
TCCTTGGCCCCCATGTGGTTTCTTTAATTTTAGATTGTGGAACCCATTTTCTTAATCCGTAATCG
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BOLD：生物条形码数据系统（barcodingoflifedatasystem）
NCBI：美国生物技术信息中心（Nationalcenterforbiotechnologyinformation）
5原理
线粒体COI基因是位于线粒体DNA的蛋白质编码基因，其长度为700bp左右，易于扩增，进化速度较快又相对保守，既有足够的变异又便于通用引物扩增，DNA序列很少有插入与缺失现象，便于序列比对分析。利用通用引物对鱼类物种线粒体COI进行PCR扩增，得到目的片段进行纯化、测序，然后将所有序列进行两两比较并计算其差异值，根据差异值来确定物种之间的关系。
6仪器与试剂
6.1仪器
水浴锅、恒温箱、纯水器、普通冰箱和超低温冰箱、台式高速冷冻离心机、PCR扩增仪、水平电泳仪、微量移液器、微量核酸蛋白测定仪、紫外观察灯或凝胶成像仪、电子天平、测序仪。
6.2试剂
3
6.2.1试剂级别
除另有规定，试验用水应为符合GB/T6682规定的一级水，所用化学试剂均为分析纯。
6.2.2引物
用去离子水将每条引物配制成100μmol/L储存液，置-20℃以下冻存；使用时取适量配制成10μmol/L工作液，避免多次冻融。序列如下，
引物
名称
5’-3’
备注
上游引物
下游引物
FishF2t1
VF2t1
FishR2t1
FR1dt1
TGTA
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