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化学发光免疫分析

化学发光免疫分析篇一：化学发光免疫分析

方法

化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理

是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物

质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激

发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定

量分析。

化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产

物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不

同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避

免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了

免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学

发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应

形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结

束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧

化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回

到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。

待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。

一、化学发光免疫分析方法的类别

化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为3大类，即化

学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析

法。

（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直

接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要

为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。

1.鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。

鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺

可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速

度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化

物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它

们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2

等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基

态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长

为425nm。

2.吖啶酯类标记的化学发光免疫分析

吖啶酯用于化学发光免疫分析方法

（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不

是很好，Klee等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有

H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定

的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖

啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430nm的光子。吖

啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于

免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效

率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常

采用HNO3+H2O2和NaOH作为发光启动试剂，有些在发光启动

试剂中加入TritonX－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以

增强发光。

（二）化学发光酶免疫分析

化学发光酶免疫分析（ChemiluminescentEnzyme

Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免

疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，

用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧

化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。

HRP最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA中，使用

过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底

物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米

诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强度。此传

统的化学发光体系（HRP－H2O2－lumi-nol）为几秒内瞬时闪光，

存在发光强度低、不易测量等缺点。后来，在发光系统中加入增

强发光剂，以增强发光信号，并在较长时间内保持稳定，便于重

复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。碱性磷酸酶（ALP）已广

泛用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。

碱性磷酸酶和1，2－二氧