酶解实验步骤 .pdfVIP

第四节：凝胶蛋白质点的酶解

一.蛋白质点酶解

准备工作：

1.检查冻干机，调好水浴锅（37C,56C）

2.检查各种试剂的量是否足够（DTTIAANHHCO）

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3.检查酶解房卫生状况

每一步注意事项：

1.每一步加入的液体量视胶块大小定，一般是50uL/管

2.每次震荡后随手甩一下，以便把胶块和管壁上的液滴甩下来

3.每次打开EP管盖子前，确认胶块在管内，并将胶块甩至管底。开盖子动作尽量轻巧，

以免胶块弹出。

4.在冻干样品后，要确保样品在管底，以防样品与封口膜一起被去掉。

酶解前配制

1）、100mmol/L的NHHCO

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参考配制10mL称79.06mgNHHCO溶于10mL水中

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以后每一步25mmol/L的NHHCO可用100mmol/L的NHHCO稀释。

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2）、1mol/L的DTT

参考配制10ML称1.55gDTT溶于10mL水中，1mL分装，避光贮存（锡

箔包），-20度永久保存

酶解步骤：调水浴锅到37C以便做脱色用，此外，调水浴锅到57C,以便做还原用。

1•冲洗胶块：用水洗衣胶块2次，

2.脱色：用含有25mmol/L的NHHCO的50%的乙腈37C保温30min。如第一次脱

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色不完全可再脱一次

3.干燥：吸出液体后，先加50%^腈，再加100%勺乙腈。

4.还原：加入还原剂，圭寸口，57T水浴一小时，还原蛋白质

还原剂：25mmol/L的NHHCO（含10mmol/LDTT）

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参考配制方法（4mL）:6.2mgDTT溶于4mL25mmol/L的NHHCO中

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注意事项：1.注意在水浴锅上写纸条标明使用者名字，水温和使用的时间段，方便实验之间的协调和

发生停电等意外情况时别的同学帮助临时处理样品。

2•水浴锅用完后恢复到还原前的初始状态，以免后来的同学做实验时因为习惯或者经验忽略此处造

成不必要的失误。

5.烷基化将样品从水浴锅中取出后，室温冷却，去掉液体，迅速加入同样体积的烷基

化试剂室温暗处放置45min,使之碘乙酰胺化。

烷基化试剂：25mmol/L的NHHCO（含55mmol/LIAA）

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参考配制方法（4mL）:40.69mgIAA溶于4mL25mmol/L的NHHCO中

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注意事项：1、样品多的时候，可以将先加了烷基化试剂的样品先放入暗处，并记住放入顺序和时

间，以便取出时按时间顺序处理。

2、注意实验时暗处的卫生情况，应该放在干净处，且建议在取出后先用酒精把样品盒擦拭后再做后

续实验。

6.反应完成后去掉液体，依次用25mmol/L的NHHCO溶液50%勺乙腈，100%勺乙

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