病毒的细胞培养.ppt

（3）细胞的换液原理：当细胞的量很少，未能铺满整个生长表面，但细胞培养液的pH值已经发生很大变化；或者是细胞形态很差等情况时，需要给细胞换液。第32页,共43页，星期六，2024年，5月操作步骤（1）吸弃或倒掉培养瓶内的旧培养液（2）加入PBS溶液清洗细胞瓶五面（3）加入足量的细胞生长液，放入37℃、5%CO2培养箱静置培养。第33页,共43页，星期六，2024年，5月（4）细胞生长状况的观察原理：应每日或隔日观察一次细胞，及时了解细胞形态、数量及培养液pH值、污染与否等情况，以便采取相应的措施处理。肉眼观察显微镜观察第34页,共43页，星期六，2024年，5月（5）细胞的冻存传代细胞应有充足的冻存储备。一则防止细胞因污染等原因造成细胞系的绝种。二则防止细胞因传的代次太多，造成细胞衰老或细胞发生变异。第35页,共43页，星期六，2024年，5月细胞冻存方法（1）选取对数生长期的细胞，用常规传代的方法将细胞制成悬液并计数，800-1000r/min离心5min，弃上清。（2）用细胞冻存液将沉淀重悬，调整细胞浓度至106-107个/ml，分装于冻存管，注明细胞名称，传代及冻存日期。（3）冷冻保存：将冻存管于4℃放置30min，然后移入-80℃超低温冰箱过夜，再放入液氮罐长期保存。亦可使用程序降温剂逐渐降温，冻存速度先为每分钟下降速度1-2℃，当温度达到-25℃时，可调整下降速度为每分钟5-10℃，温度降至-100℃时，再放入液氮罐中长期保存。第36页,共43页，星期六，2024年，5月七病毒的细胞培养以禽流感感染鸡胚成纤维细胞为例。（1）病料的处理（2）病毒分离、繁殖（3）细胞病变的观察（4）效价测定（5）中和实验第37页,共43页，星期六，2024年，5月（1）病料的处理采集疑是感染禽流感禽的心、脑、肺、淋巴结在含有双抗的PBS液中研磨，4℃过夜，3000r/min离心10min，上清通过0.22μm抽滤第38页,共43页，星期六，2024年，5月（2）病毒分离、繁殖1将病毒液稀释成多个浓度分别接种在鸡胚中，鸡胚死亡后收集尿囊液。取效价最高的尿囊液接种细胞。2将长成单层致密的鸡胚成纤维细胞液倒掉，用PBS反复清洗3次，将死亡或脱落的细胞洗掉3取0.5ml处理好的禽流感病毒液注入细胞瓶内，使病毒液充分铺满瓶底第39页,共43页，星期六，2024年，5月4将接种病毒后的细胞瓶置于培养箱中感作45min，将感作后的细胞瓶补加4.5ml营养液后置于温箱中培养512h后观察细胞病变，若无明显病变，则每隔3h观察一次。当有70%细胞发生病变后，将细胞液反复冻融3次，用吸管反复吹打数次，使病毒完全从细胞中释放出来第40页,共43页，星期六，2024年，5月正常形态的鸡胚成纤维细胞接毒后发生病变的鸡胚成纤维细胞第41页,共43页，星期六，2024年，5月（4）效价测定某些病毒具有凝集某种哺乳动物红细胞的特性，利用该特性而进行的试验称为病毒的血凝试验。第42页,共43页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第43页,共43页，星期六，2024年，5月关于病毒的细胞培养一基本原理二细胞培养的基本概念三主要优点四培养实验用品的前期处理五培养细胞的生长方式及类型六细胞培养的实验步骤七病毒的细胞培养第2页,共43页，星期六，2024年，5月一基本原理通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给与必要的生长条件。模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长与增值。在长成致密单层细胞后，将病毒接种在细胞上，置于适当环境中进行培养，逐日观察细胞病变（CPE）待75%的细胞出现CPE后收获细胞，反复冻融3次，置-70℃保存备用。第3页,共43页，星期六，2024年，5月细胞培养的基本概念传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。第4页,共43页，星期六，2024年，5月二主要优点㈠研究的对象是活的细胞。㈡研究的条件可以人为的控制。㈢研究的样本，可以达到比较均一性。㈣研究的内容便于观察、检测和记录。㈤研究的范围比较广泛。㈥研究的费用相对较经济。第5页,共43页，星期六，2024年，5月三分类原代细胞培养传代细胞培养第6页,共43页，星期六，2024年