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真核细胞表达系统

自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透

到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，

在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成

就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现,其中

多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基

因是研究基因功能及其相互作用的重要手段.

在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统,这

也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已

克隆入目的基因DNA片段的载体（一般为质粒)转化细菌（通常

选用的是大肠杆菌）,通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的

蛋白.其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需

的成本相对比较低廉.但与此同时原核表达系统还存在许多难以

克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平

进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，

过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，

导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完

善，表达产物的生物活性较低。

为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调

控领域,其优点是:

①根据原核生物蛋白与靶DＮＡ间作用的高度特异性设计，而靶

DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异

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性激活或抑制；...文档交流仅供参考...

②能诱导基因高效表达,可达105倍，为其他系统所不及；

③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关，还

可人为地调控基因表达量。

因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前,

基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞

表达系统和哺乳动物细胞表达系统文档交流仅供参考...

1、酵母表达系统

最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了

裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系

统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H

Polymorpha，ＣandiｄaBodｉni，PichiaPasｔris3种。以PichiaＰ

astoriｓ应用最多。...文档交流仅供参考...

甲醇酵母的表达载体为整合型质粒,载体中含有与酵母染色体中

同源的序列,因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵

母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一１（A0x１），

在该基因的启动子（PAXOI）作用下，外源基因得以表达.PＡXO

Ｉ是一个强启动子,在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中Ａ

Ox1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为唯一碳源时PAＸＯI可

被诱导激活,因而外源基因可在其控制下表达，将目的基因多拷

贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。此

外甲醇酵母的表达载体都为Ｅ．coli/PiｃhiaPastoris的穿梭载体，

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其中含有E.cｏlｉ复制起点和筛选标志,可在获得克隆后采用E。

ｃoli细胞大量扩增．目前，将质粒载体转入酵母菌的方法主要

有原生质体转化法、电击法及氯化锂法等.甲醇酵母一般先在含

甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表

达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外

源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加

工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化文档交流仅供参

考...

利用PAXOI表达外源蛋白时，一般需很长时间才能达到峰值水

平，而甲醇是高毒性、高危险性化工产品。使得实验操作过程中

存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生产。因此那些不需要

甲醇诱导的启动子受到青睐包括GAP、FLD1、PEＸ8、YＰTI

等多种。利用三磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡP）启动子代替PAXOI，

不需要甲醇诱导.培养过程中无需更换碳源，操作更为简便，可

缩短外源蛋白到达峰值水平的时间文档交流仅供参考...

酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统,由于兼具原核

以及真核表达系统的优点,正在基因工程领域中得到日益广泛的

应用。...文档交流仅供参考...