医院PCR核酸扩增荧光检测实验和结果分析标准操作程序.pdf

XX医院核酸扩增荧光检测编号：C009

临床基因扩增实验和结果分析第一版

检测实验室标准操作程序第1页共4页

医院PCR核酸扩增荧光检测实验和结果分析标准操作程序

1目的

保证扩增及结果分析的标准化、规范化。

2使用范围

使用LightCycler型扩增仪的核酸扩增荧光检测实验室。

3操作人

XXX

4标准程序

4.1核酸提取、纯化、扩增、产物分析的具体操作见项目SOP

文件及仪器使用SOP文件；

注：目前，SOP文件的主要依据是生产厂家提供的检测试

剂盒说明书。

4.2核酸提取、纯化、加模板在样本处理区完成；

4.3扩增反应体系的配制、分装在试剂处理区进行；

4.3制备好的扩增混合液由传递窗转移至扩增区，上机扩

增；

4.5扩增程序的编程：日常检测活动中，操作者必须遵循仪

器使用SOP文件规定的路径。编程或修改路径参照仪器

说明书；

4.6标本标识的传递：以标本唯一性标识中的“序列号”作

为检测过程中的“检验号”进行传递；

4.7工作安排：每一项目每周至少完成一个批次的检测；

4.8在移取所需体积的血清及痰液后，立即盖紧原始标本管

盖，将标本继续保存于-20℃冰箱；

4.8.1原始标本保存一周后丢弃；

4.8.2如患者及医生对标本结果有异议，则需在一周内及时

提出意见，以便重新检测复核结果；

4.9结果分析标准程序

对于LightCycler结果曲线的分析，应按以下步骤进行：

全部曲线——阴性对照——阳性对照——阳性室内质控品

——阳性标准品——逐个分析（标出阳性标本和可疑标本）

——调整参数，获得较好的标准曲线，显示定量结果——登

记，发报告。

4.9.1整体曲线的观察

将所有曲线选中进行整体观察

a）观察是否存在污染情况（包括标本污染和试剂污染），

特别应注意大量曲

线在同一Ct值出现上涨的情况。

b）观察是否有光路传导阻滞或电压波动等机器原因形成

的异常曲线。

4.9.2阴性对照的分析

阴性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知

阴性标本。

作用：用以监测实验室和前处理过程中是否存在污染。

4.9.3阳性对照的分析

阳性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知

阳性标本。

作用：用以监测实验能否正常检出阳性标本，避免假阴

性的出现。

4.9.4阳性室内质控品的分析

阳性室内质控品：试剂中加入与待检标本进行同样处理

的已知或未知浓度的阳性室内质控血清。

作用：用以监控日常实验的精密度。

4.9.5阳性标准品的分析

a）各梯度曲线的分布是否均匀，若各梯度曲线均未分开，

则表明阳模稀释可能存在问题，提示实验中存在较大人为

误差。

b）观察各曲线的Ct值是否在平日的正常位置。

情况1：若出现低拷贝标准品做不出，而各曲线Ct值均

后移，则判断是否

为试剂扩增效率下降（如试剂过期或保存条件不合格）。

情况2：出现低拷贝标准品做不出，而高拷贝曲线Ct值

均正常，则提示可能存在低拷贝阳性标准品的降解情况。

3

c）每日必做10标准品，用作以下三方面监控：

3

一是否存在操作误差，如加样量过少等原因导致10标准

品未能检出；二是否存在稀释后的梯度放置过久，低拷贝标

准品降解的情况；三是若高拷贝标准品出现Ct值后移，且

能排除情况a、b，则判断是否为试剂灵敏度下降。

4.9.6单个曲线的判断

逐个分析每条曲线，判断曲线的阴阳性或属可疑曲线。

（可疑标