年级沙门氏菌.pdf

年级：12级

系部和班级：生科系食品科学与工程四班

姓名和学号：胡姣姣1212404023

实验一食品中沙门氏菌的荧光抗体检验

一、目的与要求

1．学习和掌握免疫荧光检测技术的原理。

2．初步掌握免疫荧光检测技术的操作方法和检测结果的判定。

二、实验原理

抗体与荧光素结合后，并不影响其和相应抗原发生特异性结合反应，事先将待测抗原固

定于载玻片上，滴加荧光标记抗体，若荧光标记抗体与相应抗原发生特异性结合反应，不能

被缓冲液冲掉，在荧光显微镜下可观察到荧光，否则，荧光抗体被缓冲液冲掉，在荧光显微

镜下观察不到荧光。

三、仪器与试剂

1．载玻片76×26mm，厚0.8~1.0mm，事先刻好4×2个小方格，并编号。先用洗涤剂

彻底洗净油污，经滴检察证实无油污，再浸于95%酒精中备用。

2．盖玻片22×22mm，厚0.13~0.17mm，同上洗净，浸于95%酒精中备用。

3．荧光显微镜。

4．溶液与试剂

磷酸盐缓冲生理盐水：0.01m(pH9.0)PBS-0.85%NaCl；

固定液：按顺序将无水乙醇60ml、三氯甲烷30ml混匀，再加入36～38%甲醛10ml、

混匀4℃贮存，重复使用次数以不超过三次为宜；

pH9.0碳酸盐缓冲甘油：无水Na2CO3（分子量105.99）6g、无水NaHCO（84.01）

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37g溶于蒸馏水中，加至100ml，混匀，即成pH9.0碳酸盐缓冲液，以此一份加九份甘油混

匀即成，4℃，不超过2周为宜；

沙门氏菌多价荧光抗体试剂：选用经国家进出口商品检验局批准的以FITC标记的沙门

氏菌A-67全价“OH”免疫球蛋白（或沙门氏菌A-60多价“OH”免疫球蛋白），染色时应

按试剂所标明的常规染色工作浓度和稀释方法进行稀释后使用。稀释后的荧光抗体试剂臵

4℃贮存可使用1个月左右保持其固有的染色亮度不变。

四、实验步骤

1．试样制备对规定的直接增菌培养的肉类样品，可采用剪碎法或棉拭涂抹法而不

宜用均质器打碎法，以免细微颗粒过多干扰镜检效果。

2．增菌培养试样以SF或MM培养基增菌，培养18小时左右。

3．涂片、固定、染色

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（1）以直径为2mm的接种环取已接种的最后培养物1环，制成较薄的标本涂片，臵于

37℃温箱或室温完全晾干后，用乙醇-三氯甲烷-甲醛固定液固定5~10分钟，再用95%乙醇

浸洗后晾干（此乙醇以不重复利用三次为宜）。

（2）将沙门氏菌A-67全价“OH”免疫球蛋白试剂（染色工作浓度）滴加于各标本涂片上，

臵湿盒内经37℃、30分钟后取出，用0.01M、pH9.0PBS冲去多余的荧光抗体，另换相

同的PBS浸洗10分钟，再以蒸馏水冲洗后晾干。

（3）滴加pH9.0碳酸盐缓冲甘油后，加盖玻片。

4．镜检先以低倍镜后以高倍镜观察，记录染色亮度与菌量情况等封片。

（1）菌体荧光染色亮度评定标准

++++：黄绿色闪亮荧光，菌体周围及中心轮廓清晰

+++：黄绿色明亮荧光，菌体周围及中心轮廓清晰

++：黄绿色荧光较弱，周围及中心轮廓清晰

+：仅有暗淡的荧光，菌形尚可见

-：无荧光，或菌形不清

（2）结果判定

阳性：菌体荧光亮度达到++～+++菌体形态特征符合沙门氏菌，多数视野中均能检出数

个菌体以上。

疑似阳性：a.菌形符合，荧光亮度在++以上，但单位视野中菌量过少或仅个别视野见到

有部分菌体聚集现象；

b.荧光亮度在++以上，但菌体荧光不完整或形态不典型；

c.菌形符合，荧光亮度在+～++，但菌量较多且分布较均匀。

阴性：荧光亮度在++以下，且不属于疑似阳性范围者，均为阴性。

五、结果与讨论