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谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究

摘要：谷胱甘肽转硫酶(GlutathioneS-transferases)简称GSTs，广泛存在于动物和人体的各种组织，哺乳动物肝脏中含量最高约占肝可溶性蛋白的10%。GST是机体内一组具有重要解毒作用的同工酶家族，均为由两个亚基组成的二聚体相对分子质量为45000—49000各同工酶的等电点不同多为碱性同工酶。GST参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化物的解毒作用，GST催化这些带有亲电中心的疏水化合物与复原型谷胱甘肽GSH的亲核基团。本实验采用亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶，并测定该酶活力,米氏常数和最大反响速度并用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，计算比活力。

关键词：GSTs，亲和层析，酶活力，米氏常数，最大反响速度，比活力

前言

1.1谷胱甘肽转硫酶简介

谷胱甘肽转硫酶〔GlutathioneS-transferases〕简称GSTs，广泛存在于动物和人体的各种组织，哺乳动物肝脏中含量约占肝可溶性蛋白的10%。GST是机体内一组具有重要解毒作用的同工酶家族，多为碱性同工酶，其解毒功能主要有两方面，第一，GST参与芳香环氧化物、过氧化物和卤化物的解毒作用，GST催化这些带有亲电中心的疏水化合物与复原型谷胱甘肽GSH的亲核基团GS反响中和它们的亲电部位使产物水溶性增加，经过一系列代谢过程，最后产物为巯基尿酸，被排出体外，从而到达解毒目的。第二，GST还能共价或非共价地与非底物配基以及多种疏水化合物结合，具有结合蛋白的解毒功能。

1.2亲和层析原理

亲和层析的方法是根据具有亲和力的生物分子间可逆地结合和解离的原理建立和开展起来的。将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基，与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联，制成专一的亲和吸附剂，当被别离物随着流动相经过亲和吸附剂时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附待别离物质，通过解吸附使待别离物质得以纯化。亲和层析法别离生物大分子示意图：

1.3测定Km和V的原理

Km和最大反响速度V是酶的特征常数，不同酶的Km和V不同，受底物、pH、温度、离子强度等因素的影响。

米氏方程：

式中，v为反响初速[μmol/(L?min)]，V〔或Vmax〕为最大反响速度[μmol/(L?min)]，[S]为底物浓度(mol/L)，Km为米氏常数。Km可近似地反映酶与底物的亲和力大小：Km大，说明亲和力小；反之Km小，说明亲和力大。

将米氏方程的形式加以改变，可以得到几种方程形式，在特定条件下测得不同底物浓度[S]时相应的初速度v，用作图法测定Km和V。米氏方程是从单底物酶促反响推导出来的，但实际上这种反响很少。在多底物反响中，如果只有一种底物浓度发生变化，其他底物浓度保持不变，那么就可以将它看成单底物反响，利用米氏方程的几种形式测定Km和V值。

测定Km和V图解法

〔a〕双倒数作图法；〔b〕Hanes-Woolf作图法；〔c〕Eadie-Hofstee作图法；

〔d〕Eisenthal和Cornish-Bowden作图法；

利用米氏方程测定Km和V可以采用终止反响法，是在酶和底物反响到达预定的时间〔本实验反响时间采用1min〕时，立即参加强酸使酶变性，终止酶促反响，在这段反响时间里产物的生成量根本呈线性增加，用这段反响时间内的平均速度代替反响初速度，利用作图法，通过横截距和纵截距可以很方便地求出Km和V。

1.4考马斯亮蓝G-250染色法实验原理

考马斯亮蓝G-250CoomassiebrilliantblueG-250，CBG〕测定蛋白质含量属于一种染料结合法。CBG像指示剂，会在不同的酸碱度下变色：在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当结合蛋白质后，因为蛋白质会为CBG提供一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。游离状态考马斯亮蓝G-250的最大光吸收在465nm，CBG-蛋白质结合物最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内〔10-1000ug/ml〕，CBG-蛋白质结合物的OD595nm值与蛋白质含量成正比，故可用分光光度法进行蛋白质的定量测。

材料和仪器

2.1材料：新鲜〔冷冻〕动物肝脏

2.2试剂：

Sepharose4B；环氧氯丙烷；二氧六环；

缓冲液A：0.025mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/L二硫苏糖醇〔DTT〕，1mmol/LEDTA，0.2mol/LNaCl；

缓冲液B：0.025mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，含3mmol/LGSH，2mmol/LDTT；

注：根据酶的性质在别离纯化过程中需要参加适量的金属鳌合剂、复原剂等，以保持酶的活性。

CDNB、GSH(60mmol/L)、酶、TCA〔测定Km和V时使用〕；

酒石酸钾钠、硫酸铜、磷钼酸和磷