DB32T 2447-2013 马立克氏病病毒感染的间接免疫荧光诊断技术操作规程　　.pdfVIP

ICS65.020.30

B41

备案号：41148-2014DB32

江苏省地方标准

DB32/T2447—2013

马立克氏病病毒感染的间接免疫荧光诊断

技术操作规程

DiagnosticTechniquesofIFAforMarek’sDisease

2013-12-30发布2014-01-20实施

江苏省质量技术监督局发布

DB32/T2447—2013

前言

本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求编制而成。

本标准由扬州大学提出。

本标准由扬州大学兽医学院起草。

本标准主要起草人：金文杰、秦爱建、崔治中、殷俊、张鑫宇、刘岳龙、邵红霞。

I

DB32/T2447—2013

马立克氏病病毒感染的间接免疫荧光诊断技术操作规程

1范围

本标准规定了马立克氏病病毒感染的间接免疫荧光诊断技术中被检家禽外周血液单核细胞（PBMCs）

的制备、用特异性抗体做间接免疫荧光检测待检PBMCs感染的病毒。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3被检家禽外周血液单核细胞（PBMCs）的制备

3.1待检样品的采集

按照抗凝剂与血液1:9，新鲜采集18日龄以上待检家禽的抗凝血，抗凝剂配制见附录A。

3.2外周血液单核细胞（PBMCs）的制备

将抗凝血缓缓加入装有市售的淋巴细胞分层液的试管中，使血液重叠于分层液上，用水平转子离心

机2000转每分钟离心30分钟。用毛细管吸取PBMCs层，置离心管中，用PBS（pH7.2、0.01mol/L，下同，

配制见附录B）以1000转每分钟离心10分钟洗涤1-2次，用PBS配成细胞悬液（约107个/毫升）。

4用特异性抗体做间接免疫荧光检测待检PBMCs感染的病毒

4.1抗MDV特异性抗体

作为第一抗体，采用抗MDVgB单克隆抗体BA4和BD8（扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室制备

保存）。

4.2FITC标记抗体

由于第一抗体为MDV特异性单克隆抗体，所以选用市售的FITC标记的抗小鼠IgG山羊血清作为第二抗

体。

4.3悬浮法间接免疫荧光操作过程

a)在1.5毫升离心管中加入100微升单细胞悬液，再加入100微升第一抗体，混匀，37℃作用

45分钟；

b)将细胞重新悬浮于1毫升PBS中，以1000转每分钟离心5分钟洗涤，重复一次；

c)以100微升PBS重新悬浮，加100微升FITC标记羊抗鼠IgG抗体，置37℃作用45分钟；

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DB32/T2447—2013

d)将细胞重新悬浮于1毫升PBS中，以1000转每分钟离心5分钟洗涤，重复一次，最后一次离

心去上清备用；

e)将细胞重新悬浮于20-3