黄芩种子 ITS2 序列鉴定方法.docxVIP

1

DB14/T1403—2017

芩种子ITS2序列鉴定方法

1范围

本标准规定了黄芩种子ITS2序列鉴定的术语和定义、原理、试剂与材料、黄芩种子ITS2序列特征、种子扦样、种子处理、种子DNA提取方法、扩增与测序、序列拼接与结果判断。

本标准适用于黄芩种子ITS2序列鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

ITS2序列

在黄芩的rDNA基因中，5.8SrDNA和28SrDNA基因间隔序列称为内部转录间隔区2(ITS2)。

4原理

由于不同植物物种的ITS2核苷酸序列有差异，而同一物种不同植株间ITS2核苷酸序列保守，因此可以采用PCR扩增与测序技术对黄芩与非黄芩种子进行判断。

5试剂与材料

5.1琼脂糖

5.2抗坏血酸钠

5.3β-巯基乙醇

5.4聚乙烯吡咯烷酮（PVP）

5.510g/L溴化乙锭（EB）溶液

称取1.0g溴化乙锭（EB），溶解于100mL水中。EB有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。

2

DB14/T1403—2017

5.610mol/L氢氧化钠溶液

称取400.0g氢氧化钠（NaOH），加800mL水溶解后，再加水定容到1000mL。

5.71mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0）

称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用盐酸（HCl）调pH至8.0，用水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min。

5.8500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）

称取186.1g，乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入700mL水中，加入适量氢氧化钠溶液（5.6），加热溶解后，冷却至室温，再用氢氧化钠溶液（5.6）调pH至8.0，用水定容到1000mL。在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min。

5.95mol/L氯化钠溶液

称取292.2g氯化钠（NaCl），加800mL水溶解后，再加水定容到1000mL。在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min。

5.102%CTAB提取液

量取1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.7）100mL，5mol/L氯化钠溶液（5.9）280mL，500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（5.8）40mL和20gCTAB，溶解后，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min。

5.11TE缓冲液（pH8.0）

分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.7）和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液（5.8），加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20min。

5.12酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）溶液

按体积比为25:24:1配制酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）

5.1350×TAE缓冲液

称取242.2g三羟甲基氨基甲烷，加入300mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二铵四乙酸二钠溶液（5.8），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1×TAE。

5.14加样缓冲液

称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存备用。

5.15DNA分子量标准

清楚的区分50bp～1000bp的DNA片段。

5.16dNTPs混合溶液

将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。

3

DB14/T1403—2017

5.17TaqDNA聚合酶（5U/μL）及PCR反应缓冲液。

5.18ITS2基因引物

ITS2-F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′

ITS2-R：5′–GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′

5.19引物溶液

用TE缓冲液（5.1