实验专题模块三血液生化检验.pptVIP

实验专题模块三

血液生化检验血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清尿素氮的测定血液是在心脏和血管腔内循环流动的一种组织。成人的血液约占体重的十三分之一，相对密度为1.050～1.060，pH值为7.3～7.4，渗透压为313mmol/L。利用生物化学的方法，检测存在于血液中的各种离子、糖类、脂类、蛋白质以及各种酶、激素和机体的多种代谢产物的含量，叫做血生化检查。本专题将介绍血清蛋白与血尿素氮等两种生化指标的检测，使同学们对临床生化检验有一个初步的了解。血液由血浆和血细胞组成。血浆内含血浆蛋白（白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原）、脂蛋白等各种营养成分以及无机盐、氧、激素、酶、抗体和细胞代谢产物等。在正常生理情况下，其各种化学成分的含量非常恒定。但是，机体的生理变化和病理情况，可导致血液的某些化学成分的含量发生较大的变化。所以分析血液的化学成分可以了解人体物质代谢的状况，并协助诊断或者判断预后。12345实验一血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验目的掌握分离血清蛋白的基本原理及其临床意义。了解醋酸纤维薄膜电泳的方法及相关仪器的操作。背景与原理血清蛋白的pI都在7.5以下，在pH为8.6的巴比妥缓冲液中以负离子的形式存在，分子大小、形状也各有差异。所以在电场作用下，可在醋酸纤维薄膜上分离成A、α1、α2、β和γ五条区带。电泳结束后，将醋酸纤维薄膜置于染色液，使蛋白质固定并染色，再脱色（洗去多余染料）。将染色后的区带分别用剪刀分离出来，将其溶于碱液中，进行比色测定，最后计算出各区带蛋白质的百分数。也可将染色后的醋酸纤维薄膜透明处理后在扫描光密度计上绘出电泳曲线，并可根据各区带的面积计算各组分的百分数。+白蛋白(A)α1α2βγ血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成A、α1、α2、β和γ五条区带。蛋白名称等电点分子量白蛋白4.8869000α5.06α1：20000α2：30000β5.1290000-150000γ6.85-7.50156000-300000醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。醋酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。醋酸纤维素薄膜的特性准备与点样：将薄膜切成2.5×8cm的小块，在薄膜无光泽面距一端1.5cm处用铅笔划一线，表示点样位置。将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上（缓冲液盛于培养皿中），使膜条自然浸湿下沉。将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的膜条取出，用滤纸吸取多余的缓冲液，把膜条两端各贴于两块玻片上，使点样线空架。用血色素吸管吸取人新鲜血清3～5ul，涂于宽2厘米的点样器末端处，或用点样器在盛有血清的小烧杯中蘸一下，使其末端粘上薄层血清，然后紧按在薄膜点样线上，待血清全部渗入膜内，移开点样器。12345四、实验操作01将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（即点样面）向下，点样端置于阴极。槽架上以四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡5分钟后通电，电压为10V/cm长（指膜条与滤纸桥总长度），电流为0.4～0.6mA/cm宽，通电一小时左右关闭电源。2.电泳:02通电完毕后用镊子将膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分钟取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。3.染色:光吸收总和A总＝AA+Aα1+Aα2+Aβ+Aγ各部分蛋白质的百分数为：白蛋白%=(AA/A总)×100%;?1球蛋白%=(Aα1/A总)×100%;?2球蛋白%=(Aα2/A总)×100%；?球蛋白%=(Aβ/A总)×100%；?球蛋白%=(Aγ/A总)×100%5.计算:4.定量：取试管6支，编好号码，分别用吸管吸取0.4N氢氧化钠4ml。剪开薄膜上各条蛋白色带，另一空白部位剪一平均大小的薄膜条（作为分光光度法调零管），将各条分别浸于上色述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。约半小时后，用分光光度计进行比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白各管的吸光度值A。临床意义正常值：白蛋白：57～72%α1球蛋白：2～5%α2球蛋白：4～