VMH微量注射Leptin对大鼠能量代谢的影响.docxVIP

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VMH微量注射Leptin对大鼠能量代谢的影响

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摘要目的：探究LeptinLeptin对雄性Wistar大鼠能量代谢的影响。方法：通过下丘脑腹内侧核（VMH）微量注射Leptin，观察其对编码代谢激素的mRNA表达、食物摄入、水摄入量、热量的改变。结果：VMH注射Leptin，大鼠白色脂肪组织（WAT）中脂联素mRNA和抵抗素mRNA、棕色脂肪组织（BAT）中解偶联蛋白1（UCP-1）mRNA、以及胃粘膜组织中ghrelinmRNA和小肠粘膜组织中胆囊收缩素（CCK）mRNA表达均显著上调，而大肠粘膜组织中PYYmRNA的表达则下调，但胰腺胰岛素mRNA和胰高血糖素mRNA的表达无显著差异；，VMH微量注射Leptin，大鼠12h累计食物摄入量均显著减少；VMH微量注射Leptin，大鼠每小时产热量，每小时总能量消耗量、每小时脂肪酸氧化率、每小时耗氧量或每小时CO2产生量均显著升高。结论：VMH微量注射0.6μg/μl的Leptin可减少食物摄入并调节全身能量平衡，Leptin可能是大鼠的新型代谢肽。

关键词：Leptin；腹内侧核；摄食；能量代谢

前言

已知长期能量摄入高于能量消耗将导致肥胖的产生，但是关于能量代谢调控及摄食调控的机制十分复杂，中枢及外周信号均参与其中[1]。Leptin在大鼠肥胖症的发病中具有重要作用，因此研究人员对于Leptin结构与功能的关系进行了大量的研究[2]。研究表明Leptin具有分泌蛋白的特征，且大部分为亲水性序列，其信号肽序列位于氨基端，由21个氨基酸残基组成[3]。目前研究认为Leptin具有广泛的生理功能，如抑制食物摄入，调节能量消耗、多种激素分泌及神经内分泌、炎症反应及免疫功能[4,5]。我们对大鼠腹内侧核VMH微量注射Leptin深入分析了其对代谢的调节作用，发现Leptin确实具有厌食作用，并且当大鼠核团注射时，能够调节全身能量稳态。此外，Leptin能够改变编码关键激素的mRNA的表达，而这些激素参与调节食物摄入和能量平衡。

1材料与方法

1.1实验动物

成年雄性Wistar大鼠，体质量在220–250g，均在室温(25±2℃)、12h:12h昼夜循环光照、实验室标准饮食及自由进食和饮水的环境中饲养。实验开始前，大鼠禁食24h，但可自由饮水。VMH内注射药物后，大鼠自由摄食和饮水。所有动物实验均严格按《青岛大学实验动物保护和使用管理办法》执行。

1.2大鼠脑核团置管

大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(剂量为50mg/kg)麻醉后固定于脑立体定位仪，根据PaxinosWatson大鼠脑图谱用微量注射仪定位[12]，以前囟为零点，定位VMH(前囟前：2.4mm；旁开：0.8mm；颅骨下：8.5mm)，用牙科钻钻孔，将一不锈钢套管置于VMH，用牙科粘固剂固定，不锈钢管探针封闭导管，缝合头皮切口[17]。大鼠分笼饲养，自由饮食饮水。手术结束后大鼠连续3天给予腹腔注射8万U青霉素以防止术后感染。大鼠恢复1周后开始实验。

实验结束后经套管向大鼠VMH内缓慢注射滂胺天蓝溶液，显微镜下观察药物注射的位置是否准确。

1.3基因表达分析

确定外源性Leptin给药是否对编码mRNA的代谢激素的表达有任何影响。收集胃、小肠和大肠，胰腺和脂肪(白色和棕色)组织。在实验结束后，大鼠(n=3)腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，断头处死。快速取脑，分离VMH组织置于液氮内，并储存在-80℃冰箱。组织收集在中午开始，并在2小时内完成。根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(InvitrogenCanadaInc.，Ontario，Canada)或Aurum总RNA试剂盒(Bio-RadLaboratoriesInc.，Ontario，Canada)从10mg组织匀浆中提取总RNA。使用NanoDrop2000c(Thermo，Vantaa，Finland)测定RNA的浓度和纯度，并使用iScriptcDNA合成试剂盒(Bio-Radlaboratories，Inc.，Ontario，Canada)合成互补DNA，并通过实时RTPCR定量。

用于定量mRNA表达的引物序列和PCR条件列于表1中。使用具有SYBRGreenMasterMix的RT-定量PCR和CFXConnect实时PCR检测系统(Bio-Rad)测量基因表达，并且使用Livak方法将作为管家基因的β-肌动蛋白的表达标准化。在样品分析之前，通过验证和优化退火温度实现引物的高效率转录。样品一式两份进行，阴性对照反应混合物中不存在模板DNA。

1.4大鼠VMH微量注射Leptin对代谢的影响

大鼠被安置并