目的基因的获得酵母双杂交.ppt

进一步分析：①这种相互作用是否会在细胞内自然发生。②有些蛋白依赖于泛素的蛋白酶降解途径成员，它们具有普遍的蛋白间的相互作用。③一些实际没有相互作用的蛋白但有相同的模体蛋白也可发生相互作用。排除假阳性的措施第31页,共61页，星期六，2024年，5月原因：由于酵母转化效率较细菌低4个数量级，因此转化成为双杂交技术的重要瓶颈。解决办法：引进酵母接合型a接合型和?接合型（两者之间可形成二倍体，但自身不能）（二）转化效率偏低第32页,共61页，星期六，2024年，5月?接合型酵母细胞cDNA文库诱铒蛋白基因多克隆位点DNA-BD载体AD载体转化转化a接合型酵母细胞筛选平板生长菌苔筛选平板生长菌苔同一个三重筛选平板克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）鉴定β-半乳糖苷酶部分已商品化第33页,共61页，星期六，2024年，5月（三）阴性干扰融合蛋白的表达对细胞有毒性，该怎么办？应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。蛋白在酵母中不能稳定地表达，或者不能正确地折叠，或杂交蛋白不能转入胞核。两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。原因：第34页,共61页，星期六，2024年，5月酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。八、酵母双杂交系统使用注意事项第35页,共61页，星期六，2024年，5月酵母双杂交系统局限性某些诱饵蛋白具有自身激活性质。---------双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结构域某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位到胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系统。双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。第36页,共61页，星期六，2024年，5月酵母双杂交系统局限性有时DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位点，或破坏了融合蛋白的正确折叠。4.哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位特异性的抗体进行共定位研究。双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。第37页,共61页，星期六，2024年，5月在酵母双杂交的基础上，又发展：酵母单杂交--用于核酸和文库蛋白之间的研究酵母三杂交--三种不同蛋白之间的互作研究酵母的反向杂交--两种蛋白相互作用的结构和位点。反向双杂交系统和三杂交技术第38页,共61页，星期六，2024年，5月(一)酵母单杂交系统(one-hybridsystem)1993年，由Wang和Reed等相继创立发展出一种研究蛋白质和DNA相互作用的实验体系。WangMM,ReedRR.MolecularcloningoftheolfactoryneuronaltranscriptionfactorOlf-1bygeneticselectioninyeast.Nature，1993，364(6433):121-126.文献出处第39页,共61页，星期六，2024年，5月酵母单杂交系统原理在酵母单杂交系统中，省略了在酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体，而用特异的DNA序列取代DNAGal4结合位点。该DNA序列在相关生物系统中是重要的蛋白质结合位点。靶DNA序列特异的结合蛋白(BDPX)与Gal4P的激活结构域可融合形成融合体，BDPX与其特异DNA结合位点之间通过相互作用可激活作为表型选择性标志的报告基因的表达。第40页,共61页，星期六，2024年，5月酵母单杂交系统原理理论上，酵母单杂交系统可利用靶DNA序列，捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。该系统不仅适用于识别转录因子，也适用于研究参与转录抑制和DNA复制过程的蛋白质。第41页,共61页，星期六，2024年，5月酵母单杂交系统应用①确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。②分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因。③定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。----研究DNA-蛋白质相互作用第42