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斑点叉尾鮰病毒ORF6基因的高效可溶表达及抗原性分析

摘要：利用ＧＳＴ融合基因表达系统表达ＧＳＴ－ＧＰ６融合蛋白，以质粒ｐＭ

Ｄ１９－Ｔ－ＯＲＦ６为模板，扩增出ＯＲＦ６基因片段，将其克隆至大肠杆菌

表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－２，将所构建的重组质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＯＲ

Ｆ６转化Ｅ．ｃｏｌｉＥＲ２５６６，并诱导表达，采用ＧＳＴ蛋白纯化系统

进行纯化，所得产物进行１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ

鉴定。结果表明，大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约４２ｋＤ蛋白，其分子量与

ＧＳＴ－ＧＰ６融合蛋白相符，表达产物以可溶的形式存在。Ｗｅｓｔｅｒｎｂ

ｌｏｔ分析表明，融合蛋白能够与斑点叉尾鮰病毒（Channelcatfishvirus，ＣＣ

Ｖ）阳性血清发生特异性反应，表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。

关键词：斑点叉尾鮰病毒；ＯＲＦ６基因；高效可溶表达；抗原性

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＧＳＴ－ＧＰ６ｆｕｓｉ

ｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｕｓｉｎｇＧＳＴｇｅ

ｎｅｆｕｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．ＴｈｅgeneORF6ｗａｓａｍｐｌｉｆ

ｉｅｄｆｒｏｍｐｌａｓｍｉｄｐＭＤ１９－Ｔ－ＯＲＦ６ａｎｄｃｌｏ

ｎｅｄｉｎｔｏｐＧＥＸ－４Ｔ－２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏ

ｒ．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＧＥＸ－４Ｔ－２-

ＯＲＦ６ｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥ．ｃｏｌｉＥＲ２５６６ｃ

ｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｐｕｒｉｆｉｅｄｂ

ｙＧＳＴｐｕｒｉｆｙｉｎｇｓｙｓｔｅｍ．ＴｈｅｒｅｓｏｌｖｅｄＧ

ＳＴ－ＧＰ６ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｏｎ１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ

ｓｈｏｗｅｄａｍａｊｏｒｂａｎｄａｔｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆ４２ｋ

Ｄａｎｄｔｈｅｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｒｅｃｏｇｎｉｚ

ｅｄｂｙａｎｔｉｂｏｄｙｏｆchannelcatfishvirus（ＣＣＶ）．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：channelcatfishvirus；gｅｎｅＯＲＦ６；ｈｉｇ

ｈｓｏｌｕｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ

斑点叉尾鮰（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓｐｕｎｃｔａｔｕｓ）具有生长速度较

快、肉质细嫩、销售价格较高的特点，我国于１９８４年从美国引进后，其养殖

规模逐步扩大。但是，近年来斑点叉尾鮰病毒性疾病（Ｃｈａｎｎｅｌｃａｔ

ｆｉｓｈｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ，ＣＣＶＤ）的流行，对养殖生产的威胁

日益增加。该病为斑点叉尾鮰特有，亲鱼是传播该病给鱼苗的主要传染源［１－

２］，有较高的致死率，在一些养殖场甚至高达１００％。在美国，该病造成的

损失占疾病造成斑点叉尾鮰养殖损失的２％［３］。斑点叉尾鮰病毒（Channel

catfishvirus，ＣＣＶ）的主要结构蛋白ＧＰ６是由ＯＲＦ６基因编码的糖基化囊

膜蛋白，具有较好的免疫原性，能够诱导产生中和抗体［４－８］，在ＣＣＶ的

诊断、预防与控制等方面具有重要意义。

ＧＳＴ基因融合表达系统被广泛用于各种融合蛋白的表达，它包含一系列的

表达载体，可以在大肠杆菌和酵母等宿主细胞中表达ＧＳＴ融合蛋白，与其他系

统相比具有表达效率高、纯化蛋白效果好，操作简便等特点，表达的蛋白质可用

于制备抗体和在体外研究蛋白质的相互作用［９］。本研究采用ＧＳＴ基因融合

表达系统和原核高效表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－２在Ｅ．ｃｏｌｉＥＲ２５６

６细胞中高效可溶表达ＣＣＶ的ＧＰ６蛋白，并对重组蛋白进行了纯化，突破了

一般大肠杆菌表达载体以包涵体形式表达外源蛋白的瓶颈，为进一步研究ＧＰ６

蛋白的结构与功能奠定了基础。

１材料与方法

１．１菌株与载体

质粒ｐＭＤ－１９－ＯＲＦ６为本实验室前期构建。Ｅ．ｃｏｌｉＥＲ２

５６６为本实验室保存。表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－２购自Ａｍｅｒｓｈａｍ

ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ公司。

１．２酶类及主要生化试剂

ＰｆｕＤＮＡ聚合酶购自Ｓａｎｇｏｎ公司，蛋白酶Ｋ、Ｔ４ＤＮＡ连接

酶和限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＸｈｏⅠ等均购自宝生物工程（大连）有限公司；

ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、低分子量蛋白标准购自Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司