《生物技术制药》第2章基因工程制药-3.pptx

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基因工程制药基因工程制药GeneEngineeringforPharmaceutics(三)

基因工程制药1、基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。2、宿主细胞的分类:①原核细胞,常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等;②真核细胞,常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。知识回顾

基因工程制药3、影响外源基因在E.coli表达的因素:(1)外源基因的剂量(2)外源基因的表达效率(3)表达产物的稳定性(4)细胞的代谢负荷(5)工程菌的培养条件知识回顾

基因工程制药4、真核基因在大肠杆菌中的表达形式:⑴以融合蛋白的形式表达药物基因⑵以非融合蛋白的形式表达药物基因⑶分泌型表达药物基因知识回顾

基因工程制药学习内容基因工程菌的不稳定性基因工程菌的培养

基因工程制药2.5基因工程菌的不稳定性及对策基因工程菌的稳定性是高水平发酵生产的基本条件;基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。

基因工程制药质粒plasmid是存在于细菌等微生物细胞染色质以外的共价闭环的双股DNA分子,具有独立自主复制和调控能力,可赋予宿主细胞一定的生物性状。2.5.1质粒的不稳定性

基因工程制药2.5.1质粒的不稳定性分类:分裂不稳定:指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定:指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

基因工程制药质粒分裂不稳定的原因⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率,质粒丢失率与宿主菌、质粒特性和培养条件有关;⑵这两种菌比数率差异的大小。质粒结构不稳定的原因⑴质粒自发缺失与质粒中的短正向重复序列之间的同源重组有关,具有两个串联启动子的质粒更容易发生缺失;⑵无同源性的两个位点之间也发生缺失;⑵培养条件。2.5.1质粒的不稳定性

基因工程制药质粒稳定性(stability)的分析方法样品不含抗性标记抗生素平板培养基10-12h100个菌落含抗性标记抗生素平板培养基10-12h统计生长菌落数重复三次,计算比值(稳定性stability)

基因工程制药2.5.2提高质粒稳定性的方法选择合适的宿主菌选择合适的载体选择压力分阶段控制培养控制培养条件固定化

基因工程制药宿主菌的遗传特性对质粒的稳定性影响很大。宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等都会影响质粒的稳定性。提高质粒稳定性的方法

基因工程制药含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒的子代菌的频率较大,因而对这类工程菌增加质粒考贝数能提高质粒的稳定性;对同一工程菌来说,通过控制不同的比生长速率可以改变质粒的考贝数。提高质粒稳定性的方法

基因工程制药菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。高生长数率时质粒拷贝数下降,但稳定性增加。生长数率/h0.20.4质粒拷贝数10.5-半乳糖苷酶工程菌的连续养3提高质粒稳定性的方法

基因工程制药选择压力:1)抗生素抗性基因:在培养基中加选择性压力如抗生素等,是工程菌增养中提高质粒稳定性常用的方法。2)营养缺陷型宿主菌提高质粒稳定性的方法

基因工程制药外源基因表达水平越高,重组质粒越不稳定。由于外源基因高效表达造成质粒不稳定时,可以考虑将发酵过程分阶段控制。第一阶段使菌体生长至一定密度,第二阶段诱导外源基因的表达。提高质粒稳定性的方法

基因工程制药工程菌的培养条件对其质粒的稳定性和表达效率影响很大。培养条件的变化对大肠杆菌的比生长速率有很大的影响,而基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性也有很大影响,提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。提高质粒稳定性的方法

基因工程制药固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性。基因重组大肠杆菌进行固定化后,质粒的稳定性及目的基因产物的产率都有了很大提高。提高质粒稳定性的方法

基因工程制药2.7基因工程菌的培养培养工艺是发酵工艺的重要组成部分,对外源蛋白的表达至关重要,直接影响产品的产量和质量,从而影响产品成本及市场竞争力。最佳的培养工艺还要考虑对纯化工艺的影响。

基因工程制药基因工程菌生长代谢的特点菌体的生长通常用比生长速率来表示。比生长速率:菌体生长速率与培养基中菌体浓度之比。工程菌培养可通过选用不同的碳源、控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。

基因工程制药大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的,因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。培养条件的改变,都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应,影响生物大分子的和成和菌体的生长。

基因工程制药Viewpoint1:能量的供应决

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