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检测细胞DNA断裂损伤效应的彗星实验法的改良

赖金龙;付倩;任莎;吴国;陶宗娅;张红;罗学刚

【摘要】为了解决彗星实验过程中常出现的脱胶、细胞核分离操作繁琐、重复性

低等问题,对彗星实验方法进行了改良,初步建立了彗星实验的快速操作流程.结果显

示,通过对载玻片进行预处理,可确保凝胶悬挂均匀;采用改良机械法分离的细胞核浓

度适中;以0.5％(w/v)涂层琼脂糖作为基层、以1.5％(w/v)低熔点包埋琼脂糖作为

叠加层的“双层凝胶法”,辅以“推片法”铺胶,操作便捷且不发生脱胶现象;细胞核

膜经裂解处理后再进行电泳和荧光观察,彗星图像清晰,杂质少.应用改良后的彗星实

验方法,操作简便,耗时更短,实验效果良好,可快速检测出细胞DNA损伤效应.

【期刊名称】《生态毒理学报》

【年(卷),期】2015(010)004

【总页数】8页(P195-202)

【关键词】铯;蚕豆根尖细胞;遗传毒性;DNA损伤;彗星实验;改良

【作者】赖金龙;付倩;任莎;吴国;陶宗娅;张红;罗学刚

【作者单位】四川师范大学生命科学学院,成都610101;四川师范大学生命科学学

院,成都610101;四川师范大学生命科学学院,成都610101;四川师范大学生命科学

学院,成都610101;四川师范大学生命科学学院,成都610101;四川师范大学生命科

学学院,成都610101;西南科技大学教育部生物质材料教育部工程研究中心,绵阳

621010

【正文语种】中文

【中图分类】Q331

彗星实验(cometassay)也称单细胞凝胶电泳实验(singlecellgel

electrophoresis,SCGE)，是一种操作简单、有效评估细胞DNA损伤的方法[1]。

其原理是器官或组织细胞受外源因素(如辐射、重金属等)影响，细胞中的DNA发

生单链或双链断裂，经裂解后，DNA解旋，在电场作用下，DNA断片迁移出细

胞核，形成彗星状的电泳图谱；而正常细胞的大分子量DNA在电场作用下迁移距

离较短，DNA仍保留在细胞核的范围，形成圆形或轻微拖尾的图谱[2]。根据电泳

缓冲液的pH不同，可分为中性彗星实验(pH=8.4)和碱性彗星实验(pH13)，前

者主要用于检测DNA双链的断裂损伤，而后者则具有更高的灵敏性，可用于检测

更少量的单链和双链断裂损伤[3-5]。目前，彗星实验技术已广泛用于环境毒理学、

生物监测、辐射生物学等领域[6-10]。

但彗星实验的灵敏度和结果的重复性易受低熔点琼脂糖浓度、裂解时间、电泳缓冲

液组分、电泳条件等较多因素的影响；常用的“三明治”型的包埋法操作繁琐、易

脱胶[11]，机械法分离细胞核的效果不佳等因素[12]，限制了此法的广泛应用。因

此，建立一套快速、简单的实验流程尤为重要。本研究室通过对彗星实验方法的改

良，已建立一套成熟的彗星实验流程，解决了长期存在的脱胶、机械法分离细胞核

效果差、重复性低等问题，可快速检测出DNA的损伤效应。本文选用对环境污染

物较为敏感的蚕豆为试材，以铯(133Cs+)为外源处理因子，以“中性彗星实验”

为例，详细介绍实验操作流程、比较改良前后的检测效果及数据处理方法，为应用

彗星实验检测细胞DNA损伤提供方法学指导。

1.1仪器设备

玻璃培养皿；冰盘；冰盒；1～10μL，10～100μL，100～1000μL移液器和枪

头；1.5μL扣盖离心管；解剖刀；脱色摇床(KB-900，海门其林贝尔)；尼龙布(孔

径200μm)；5mL注射器；天平(精度0.001g)；微波炉(EG823LA3-NR，美的

微波电器制造有限公司，佛山)；恒温水浴锅(HWS26型，上海百典仪器设备有限

公司)；载玻片(带磨砂边)；盖玻片；水平电泳槽(DYCP31DN型，北京六一仪器

厂)；稳压电泳仪(DYY-6C型，北京六一仪器厂)；计时器；徕卡正置荧光显微镜

(DM3000，德国徕卡微系统有限公司)：100～400倍，蓝色激发光波长46