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定点饱和突变提高L-脯氨酸-4-羟化酶的酶活

周海岩;李会帅;王培;柳志强

【摘要】为了提高L-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)合成反式-4-羟基-L-脯氨酸(4-Hyp)

的能力,首先对实验室前期构建的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET-28b-p4h

的P4H进行三维结构模拟和\热点\氨基酸分析,选择了7个位于\疏水口袋\附

近的氨基酸残基(Y205,K207I241,F137,T142,V53和R45)进行定点饱和突变,得到

P4H酶活力明显提高的突变型酶F137R和Y205K.采用F137R和Y205K催化转

化0.35g/LL-脯氨酸产物4(Hyp质量浓度分别为55.09mg/L和52.29mg/L),比

野生型酶分别提高了58％和50％.经过分子对接比较发现,突变型P4H的活性中

心没有发生显著变化,酶活的提高可能是由于突变作用使蛋白构型发生了轻微改变,

增加了该酶与底物或辅底物的亲和力引起的.该结果为进一步利用P4H生物合成4-

Hyp提供了重要的理论基础.

【期刊名称】《发酵科技通讯》

【年(卷),期】2018(047)004

【总页数】6页(P193-198)

【关键词】L-脯氨酸4-羟化酶;反式-4-羟基-L-脯氨酸;生物催化;定点饱和突变

【作者】周海岩;李会帅;王培;柳志强

【作者单位】浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大

学,浙江杭州310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州310014;

浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州

310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州310014;浙江省生物

有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州310014;生

物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州310014;浙江省生物有机合成技

术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州310014;生物转化与生

物净化教育部工程研究中心,浙江杭州310014

【正文语种】中文

【中图分类】Q814.9

反式－4－羟基－L－脯氨酸（4－Hyp）是一种应用广泛的高附加值非天然氨基酸

［1］。在化工领域4－Hyp可作为手性原料合成多种聚合物［2］。在动物饲料

应用上，添加4－Hyp可防止因甘氨酸合成不足而导致的营养不良现象的发生

［3］；在医药领域，可作为原料用于合成碳青霉烯类抗生素［4］。此外，4－

Hyp还具有消除氧化剂和调整细胞的氧化还原状态的潜在效果［5］，因此许多高

级化妆品中都添加有4－Hyp，以期延缓衰老［6－7］。4－Hyp市场需求呈现逐

年递增的趋势，目前国内市场售价超过60万元／t。4－Hyp的制备方法主要有蛋

白水解法、生物催化和发酵法。蛋白水解法［8－10］是目前4－Hyp的主要制备

方法，但其路线长（保护／去保护）、环境污染严重、成本高，得率只有4%～

7%。因此，绿色、高效、低成本的4－Hyp的生物合成技术的开发具有广阔的发

展前景［11］。4－Hyp的生物合成方法包括生物催化和发酵法［12］，其中高

活性L－脯氨酸－4－羟化酶（P4H）的挖掘和开发是生物法合成4－Hyp能否成

功的决定性因素。P4H属于Fe2＋／α－酮戊二酸（α－KG）依赖型双加氧酶，一

般存在于细菌中，可在Fe2＋，α－KG存在的条件下将游离的L－脯氨酸4－位羟

基化［13］。Shibasaki等通过高效筛选首次从微生物指孢囊菌RH1中获得了

P4H，然后将该基因进行克隆和异源表达，构建了表达P4H的重组大肠杆菌，该

菌株在含有底物L－脯氨酸的发酵培养基中进行培养，100h后可积累41g／L4－

Hyp［14－15］。为了降低4－Hyp的生产成本，Shibasaki等在4－Hyp生产

中过表达L－脯氨酸合成的关键酶基因，以葡萄糖为碳源发酵96h后，4－Hyp产

量达到了25g／L［16］。Yi等尝试了以谷氨酸棒状杆菌作为宿主表达P4H并生

物合成4－Hyp，但结果与重组大肠杆菌相比并不理想［17］。刘合栋等将优化后

的P4H基因克隆到含有色氨酸串联启动子的pUC19质粒中，并在大肠杆菌BL21