产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛抗原成熟肽的克隆表达及部分免疫学特性的分.pdf

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２８・《上海畜牧兽医通讯》２００８年第３期

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产肠毒素性大肠杆菌Ｋ９９菌毛抗原成熟肽的克隆表达及部分免疫学特性的分析

姜文亿盛金良王远志陈创夫

（１新疆石河子大学动物科技学院８３２００３２新疆地方与民族高发病重点实验室８３２００３）

摘要】采用ＰＣＲ方法，以８３９１【２（含Ｋ９９）标准株茵液为模板扩增Ｋ９９茵毛基因，克隆至ｐＢＳ—Ｔ载体。提取阳

性质粒，进行ＰＣＲ和酶切鉴定。经测序正确后，构建原核表达载体ｐＥＴ一２８ａ—Ｋ９９，将重组质粒转入大肠杆菌ＢＬ２１

（ＤＥ３）中，经ＩＰＴＧ诱导表达后，茵体蛋白经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ，在约１８Ｋｕ有一明显特异性条带，表达产物经初步纯化后，

免疫印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析证实，此重组蛋白与Ｋ９９阳性血清发生特异性反应。然后将初步纯化的重组蛋白

免疫实验兔，并设对照组，建立间接ＥＬＩＳＡ法进行抗体检测，分析表达产物的抗原性和免疫原性，并对各组进行攻毒

试验，为进一步对幼畜腹泻疫苗的研制奠定基础。

关键词：大肠杆菌Ｋ９９；茵毛抗原；克隆表达；免疫学特性分析

腹泻是影响畜牧业发展的重要疫病，因肠毒素性大肠杆１．３买验动物

菌引起的新生幼畜腹泻发病率高达３０％～５０％，死亡率达实验用小鼠（１７～２２ｇ）购于石河子大学实验动物中心。

１０％～３０％，经济损失巨大…。药物治疗幼畜腹泻效果不１．４ＰＣＲ扩增目的基因

好，且易产生耐药性，因而免疫预防是最佳选择。国内外曾培养１０ｈ的Ｃ８３９０２菌液作为Ｋ９９基因ＰＣＲ扩增的模

采用灭活疫苗或自场活苗等免疫妊娠母畜，但副作用大，效板。ＰＣＲ扩增体系：１０×ｂｕｆｆｅｒ２ｌ，Ｋ９９上、下游引物各

果也不理想。基因工程疫苗具有副作用小、安全、高效等特０．３Ａｔ，ｄＮＴＰ０．８Ａｔ，ＭｇＣｌ２１．２Ａｔ，Ｋ９９ＰＣＲ模板ｌ／＊１，Ｔａｑ

点成为新型疫苗的研究方向。ＤＮＡ聚合酶０．３ｐ．１（５Ｕ／ｔｄ），去离子水补足到１３．９”ｌ。扩

产肠毒素性大肠杆菌（ＥＴＥＣ）的毒力因子主要包括黏附增参数：９５℃预变性４ａｒｉｎ，９４℃３０Ｓ，５７℃４０Ｓ，７２℃

索、肠毒素、水肿病毒素、内毒素、溶血素以及ＥａｔＡ。其中黏４０Ｓ，３０个循环，７２℃１０ｍｉｕ。经１．０％琼脂糖凝胶电泳分

附素和肠毒素在发病学和免疫学方面起很重要的作用【２ｊ。析ＰＣＲ产物。

Ｅ１、ＥＣ定居宿主小肠上皮细胞的能力是由菌体表面的宿主１．５重组克隆载体的构建和筛选

特异性菌毛介导的【３ｊ。这种ＥＴＥＣ特有的菌毛与普遍存在Ｋ９９ＰＣＲ产物经回收纯化后，克隆到ｐＢＳ—Ｔ载体上，

于大肠杆菌的Ｉ型菌毛不同，通常称为黏附素或定居因子转化ｔｏｐｌ０感受态细胞，挑取白色菌落Ｉ。５经ＰＣＲ鉴定，并

（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）。猪源产肠毒素性大肠杆菌的黏附素抗用ＸｈｏＩ和ＮｃｏＩ双酶切鉴定重组质粒，送北京奥科生物技术

原主要有Ｋ８８（Ｆ４）、Ｋ９９（Ｆ５）、９８７Ｐ（Ｆ８）和Ｆ４１，肠毒素包括有限公司进行测序，初步鉴定为阳性的克隆，命名为ｐＢＳ—Ｋ９９。

耐热肠毒素与不耐热肠毒素。我国仔猪腹泻病原黏附素１．６表达载体的构建和测序

ｓ０％以上是Ｋ８８ａｃ型，犊牛羔羊腹泻病原的黏附素中Ｋ９９及用ＸｈｏＩ和ＮｃｏＩ双酶切ｐＢＳ—Ｋ９９重组质粒，将Ｋ９９片