第六章 免疫学检测技术课件.ppt

06第六章免疫学技术如某抗原的IC50浓度为90Pg/管，而一些近似抗原物质IC50浓度几乎是无限大，可以说这一抗血清与其它抗原物质的交叉反应率近似零，即无交叉反应，该抗血清的特异性是好的。06第六章免疫学技术3．亲合力抗体与结合抗原体的活度或牢固度。影响亲合力的因素：抗原分子的大小抗体分子的结合位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度。06第六章免疫学技术亲合力常以亲合常数K表示。K的单位是升/摩尔（L/mol）。K是该抗血清能达到的最小检出量（灵敏度）的倒数，K=1/[H]，[H]是最小检出量，通常，K的范围在10～10L/mol之间，也有高达10L/mol的。计算亲合常数的方法20余种，计算出的K都不能真实反映实验情况，只能作为参考。8121406第六章免疫学技术(七）免疫失败的原因及措施1、动物的种属及品系是否合适？可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。2、抗原质量是否良好？可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。3、制备的免疫原是否符合要求？可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。06第六章免疫学技术4、佐剂：乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。5、免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间、次数，免疫的途径是否合适？6、动物的饲养：如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。06第六章免疫学技术二、单克隆抗体的制备（一）动物的选择与免疫1．动物：纯种BALB/C小鼠较温顺。离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。06第六章免疫学技术2．免疫方案：至关重要（1）可溶性抗原免疫：一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。06第六章免疫学技术初次免疫：抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓2-3周后取脾融合↓3天后06第六章免疫学技术（2）颗粒抗原免疫：不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×10个细胞。7初次免疫1×10/0.5mlip↓2～3周后第二次免疫1×10/0.5mlip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×10/0.5mlip或iv↓取脾融合77706第六章免疫学技术（二）细胞融合1．细胞融合前准备（1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表。06第六章免疫学技术常用于融合试验的骨髓瘤细胞系06第六章免疫学技术骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以10～5×10/mL为宜，最大浓度不得超过10/mL细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。45606第六章免疫学技术（2）饲养细胞：组织培养中，单个或少数分散的细胞不易繁殖，加入其它活细胞后可促进这些细胞的繁殖，所加入的这种细胞称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞如：小鼠腹腔巨噬细胞，小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。饲养细胞的量为一般为2×10或10细胞/孔。4506第六章免疫学技术2．细胞融合的步骤（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周龄↓拉颈处死，浸泡在75%酒精内，3～5min↓用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜↓用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管）↓反复冲洗，吸出冲洗液↓冲洗液放入10ml离心管，1200rpm，离心，5～6min↓用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细