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人非小细胞肺癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验具体步骤及方法

将表达GFP的质粒pRNAT-U6/Neo转染人肺腺癌细胞A549，G418筛选获得稳定表达

GFP细胞，对比转染前后细胞的生长活性和成瘤性。将转染后细胞原位种植裸鼠预定标准

处死。HE染色和免疫组化检测转移灶的位置和数目。利用KODAKIS2000MM系统检测

肿瘤播散情况。

一、实验材料准备

1.BALB/cnu/nu裸鼠40只，雄性，4-6周龄，体重18-20g，无特定病原体(SPF)级饲

养。

2.肺腺癌细胞株A549，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基(美国Gibcobrl公

司)，5%CO37℃培养，常规传代。

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3.质粒和筛选药物质粒pRNAT-U6/Neo(美国Genscript公司)，携带Neomycin耐药基

因供筛选，在CMV启动子控制下编码cGFP作为转染标记物。G418(美国Promega公

司)800mu;g/ml初筛后200ug/ml维持筛选。

二、细胞的转染

1.哺乳动物磷酸钙转染系统(美国Promega公司)，按照操作指南将质粒pRNAT-

U6/Neoo转入A549细胞，转染后24~48h荧光显微镜下观察转染效率。

2.后培养液内加G418筛选获得稳定转染。

3.利用平板克隆形成试验测定细胞克隆形成率10%后，有限稀释法获得表达GFP阳性

细胞。

4.1月后收获转染细胞，常规传代培养，培养液中加G418(200ug/ml)维持筛选。

5.测定转染后A549细胞增殖动力学指标，对比转染前后A549细胞生长曲线，检测转染

后细胞的生长活性是否受转染的影响。

6.待细胞增殖达一定数量后，裸鼠皮下注射转染前后细胞，记录成瘤时间，用公式

V=1/2x长x宽计算肿瘤体积，对比转染前后两组裸鼠的瘤体大小以检测成瘤性是否有差

别。

三、人肺腺癌A549裸鼠原位种植模型的建立

1.取转染后细胞，用不含血清的RMPI1640培养液冲洗2次并调整细胞最终浓度为

5x10/0.2ml备用。

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2.用0.5%的戊巴比妥钠(50mg/kg)(中国医药上海化学试剂公司)腹腔注射麻醉裸鼠，用

26号针头吸取细胞悬液0.2ml注射入裸鼠左侧胸腔，注射过程中注意控制刺入针头的深

度。

3.整个操作过程在细胞收获后半小时内完成，严格遵循无菌原则。

4.注射后在KODAKIS2000MM下确认原位种植成功，注射部位为胸腔。

5.注射后继续饲养，隔天观察一次并记录体重。

6.当裸鼠出现精神萎靡、呼吸短促、弓背并明显消瘦，体重较注射Et减轻20%时，颈椎

脱位术处死裸鼠。

7.开胸观察，取出器官，用10%甲醛固定保存。

四、检查项目

1.转染后细胞荧光显微镜成像转染后24～48h荧光显微镜下观察，确认转染成功。单克

隆化过程中镜下观察细胞克隆生长情况。

2.活体GFP标记成像检测应用KODAKIS2000MM进行活体荧光成像，确认注射部位为

胸腔，后间断应用以活体确认瘤细胞的远处转移。

3.解剖学与组织学检查处死的裸鼠均经

详细解剖学检查，取出器官、固定包埋后，以4tun厚度连续切片，切片严格编号，奇数

号行HE染色，光镜观察，以初步确定转移灶。

4.免疫组织化学染色

选择肺脏、肝脏和脑作为主要研究器官，在HE染色确定转移灶位置的基础上，取相邻偶

数号码的切片进行免疫组化检测，CEA鼠抗人单克隆抗体(ZM-0062)，LRP鼠抗人单克隆

抗体(ZM．0335)工作液，即用型SP超敏感免疫组化染色试剂盒(sP-9000)、抗原修复

液、DABKit显色试剂盒(zU一9032)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

五、统计学处理

细胞的生长活性和肿瘤体积x±s表示，数值的比较采用方差分析。HE检测结果和活体

成像检测结果的比较用x检验。采用SPSSl3．0软件进行统计分析。

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注意事项

原位种植法模拟肺癌发生的自然环境