第3章 基因工程（知识清单）期中考点大串讲.docxVIP

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第三章基因工程

第一节重组DNA技术的基本工具

一、DNA基因工程的基本工具

DNA基因工程至少需要三种工具：“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）；“分子缝合针”——DNA连接酶；“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体。

（1）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）

①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

②功能：能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。

③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：粘性末端和平末端。

（2）“分子缝合针”——DNA连接酶

①两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：

a.相同点：都缝合磷酸二酯键。

b.区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。

②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。

（3）DNA连接酶——“分子缝合针”

①作用:将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

②?种类:

种类

来源

特点

E.coliDNA连接酶

大肠杆菌

只能“缝合”具有互补粘性末端的双链DNA片段

T4DNA连接酶

T4噬菌体

既可以“缝合”双链DNA片段互补粘性末端，又可“缝合”双链DNA片段的平末端。

（4）“分子运输车”——载体

①载体具备的条件：

a.能在受体细胞中复制并稳定保存。

b.具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。

c.具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。

③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒

二、DNA的粗提取与鉴定

1.?实验原理:

(1)DNA、?RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面有差异,?选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。

①DNA?不溶于酒精,?某些蛋白质溶于酒精,?分离?DNA?和蛋白质。

②DNA?能溶于?2mol/L?的?NaCl?溶液。

(2)DNA?遇二苯胺试剂会呈现蓝色。

2.?方法步骤:

(1)?研磨:取?30g?洋葱切碎,?倒入?10mL?研磨液研磨。

(2)?除杂:?漏斗中垫上纱布过滤后,?在?4℃冰箱静置后取上清液,?1500r/min?的转速下离心后取上清液。

(3)?提取:?加入体积相等、体积分数?95%酒精,?溶液出现白色的丝状物是?DNA。

方法一:?用玻璃杯按一个(填“一个”?或“两个”)?方向搅拌，卷起丝状物，用滤纸吸去上面的水分。

方法二:?10000r/min?的转速下离心?5min,?取沉淀物晾干。

（4）鉴定:

项目

A

B

2mol/L的Nacl溶液5mL

丝状物或沉淀物

不加

加入

二苯胺试剂4mL

沸水中加热5分钟

现象

无色

蓝色

DNA?的鉴定和还原糖的鉴定都需要加热,?它们有什么不同?

提示:还原糖加斐林试剂后,?置于?55～65℃热水中加热;?而?DNA?加二苯胺试剂后,?置于沸水中加热。

第二节基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。

1.第一步：目的基因的获取

（1）目的基因是指：?编码蛋白质的结构基因?。

（2）原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因常用方法有反转录法和化学合成法

（3）PCR技术扩增目的基因

①原理：DNA双链复制

②过程：

a：加热至90-95℃DNA解链；

b：冷却到55-60℃，引物结合到互补DNA链；

c：加热至70-75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

2.第二步：基因表达载体的构建

（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

（2）组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因

①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段?，位于基因的尾端。

③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。

3.第三步：将目的基因导入受体细胞

（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内