DNA重组技术PPT课件.ppt

DNA重组技术;概述

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;内容提要;DNA重组与DNA重组技术;DNA重组(DNArecombination)：

DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。;转化;接合;转导;融源性转换;DNA重组技术(DNArecombinanttechniques)：

用人工手段对DNA进行改造和重新组合的技术。包括对DNA分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等等，是基因工程技术的核心。;DNA重组技术的理论基础;DNA重组技术发展简史;重组DNA技术来源于两个方面的基础理论研究

限制性核酸内切酶（简称限制酶）

基因载体（简称载体）。;限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用; 1952年美国分子遗传学家S.E.卢里亚在大肠杆菌中所发现的一种限制现象——从菌株甲的细菌所释放的噬菌体能有效地感染同一菌株的细菌，可是不能有效地感染菌株乙；少数被感染的菌株乙的细菌所释放的同一噬菌体能有效地感染菌株乙可是不能有效地感染菌株甲。; 阿尔伯（Arber,Werner）研究表明，细菌细胞能够通过一种“限制酶”的存在来保护自己，抵御噬菌体的攻击。这种限制酶通过分裂噬菌体的DNA使之大部或全部失活，从而遏制噬菌体的生长。到1968年，阿尔伯收集了足够多的关于限制酶的资料，终于能够证明一种特别的限制酶的存在，它只分裂那些含有为噬菌体所特有的某种序列的核苷酸。; 内森斯（Nathans,Daniel）与史密斯合作，研究了能在特定部位分裂DNA分子的酶。这使人们有可能对已知的大得足以带有遗传信息的核酸片断进行研究。这项研究于1971年完成，以后又导致了旨在把核酸拆开再按其它结构加以组装的重组DNA的研究工作。; 史密斯在研究流感嗜血杆菌从??菌体P22接受DNA的机制时，于1968年发现了一类新的限制酶，它们分别在特定部位切断DNA分子，因此可用以研究DNA分子中核苷酸的顺序和用于DNA重组技术。;基因载体（简称载体）;主要方法和技术路线;重组DNA技术包括：;;DNA克隆的基本过程;基因工程技术策略;限制性核酸内切酶——“分子手术刀”

DNA连接酶——“分子缝合针”

基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”;限制性核酸内切酶

DNA聚合酶I

逆转录酶

DNA连接酶

碱性磷酸酶

末端转移酶

TaqDNA聚合酶;限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）

识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。

是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回文结构。

······GGATCC······

······CCTAGG······;限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：

钝性末端(bluntend)

粘性末端(stickyend);

5′-端突出

粘性末端

3′-端突出

限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。

不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端（compatibleend），可用连接酶连接。;限制酶;①利用限制酶取得具有粘性末端或平整末端的 DNA片段；

②用机械方法剪切取得具有平整末端的DNA片 段，例如用超声波断裂双链DNA分子；

③经反向转录酶的作用从mRNA获得与mRNA 顺序互补的DNA单链，然后再复制形成双链 DNA（cDNA）；

④用化学方法合成DNA片段。;载体连接;DNA连接酶——“分子缝合针”;基因的载体——“分子运输车”;;质粒（plasmid）

是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。;质粒载体

的一般结构;DNA克隆常用载体;噬菌体（phage）DNA

λ噬菌体DNA改造系统

λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）

EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列; 其他

柯斯质粒（cosmid）

酵母人工染色体载体

（yeastartificialchromosome,YAC）

细菌人工染色体