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新型冠状病毒BF.7变异株的分离鉴定与基因序列特征分析

【摘要】目的分离新型冠状病毒(severeacuterespiratorysyndromecoro

navirus2,SARS-CoV-2)流行株并进行鉴定,对分离株和传代培养物开展序列特

征分析。方法对2022年12月收集的11份SARS-CoV-2抗原初筛呈阳性的鼻

咽拭子样本进行病毒分离。实时荧光定量PCR检测SARS-CoV-2核酸,核酸阳性样

本接种Vero细胞进行病毒分离,Westernblot和间接免疫荧光法检测病毒抗原,

透射电镜观察病毒形态。提取病毒分离株及后续传代培养物核酸,对病毒基因组

测序并进行序列分析。结果11份样本实时荧光定量PCR检测结果均为SARS-C

oV-2阳性。成功分离出7株SARS-CoV-2,其在Vero细胞中可连续稳定传代,滴度

可达106.25细胞培养半数感染量(50%cellcultureinfectiousdose,CCID5

0)/ml。Westernblot和间接免疫荧光结果显示病毒分离株可被SARS-CoV-2单

克隆抗体和恢复期血清特异性识别;透射电镜观察到病毒颗粒呈球形,直径约为

100nm;通过二代测序技术成功获得病毒全基因组序列,序列分析结果显示,7株

分离株均为SARS-CoV-2,与Wuhan-Hu-1株(NC-045512)序列同源性99.50%,7株

分离株之间序列同源性为99.98%,同属于OmicronBF.7进化分支。对BJ-NVSI-2

0230005分离株连续传代和蚀斑纯化后进行序列分析,结果显示4~6与1~3代病

毒相比,ORF1ab基因和E基因分别有1个核苷酸位点发生突变和3个核苷酸的缺

失,其中ORF1ab基因C→T突变导致亮氨酸变为苯丙氨酸;E基因3个核苷酸缺失

导致缬氨酸缺失。蚀斑纯化克隆序列存在多态性。结论成功分离的7株SARS-

CoV-2流行毒株均为BF.7进化分支,与中国大陆2022年12月流行趋势一致。

【关键词】病毒分离;新型冠状病毒;实时荧光定量PCR;系统进化分析

新型冠状病毒(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2,SARS

-CoV-2)为有包膜的线性单股正链RNA病毒[1-3],基因组长约30000个核苷酸,

是引起COVID-19的病原体。SARS-CoV-2基因组编码4种主要结构蛋白,分别是

刺突(spike,S)蛋白、核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白、膜(membraneprotein,

M)蛋白和包膜(envelopeprotein,E)蛋白[4-5]。

自2020年12月以来,SARS-CoV-2出现了快速变异并加速了病毒传播,英国

变异株(lineageB.1.1.7)的传染性增强了约50%[6],并被WHO归类为第一种关切

变异株(variantsofconcern,VOCs),称为Alpha变异株[7-8]。随后出现了Bet

a、Gamma和Delta变异株等VOCs。

2021年末,Omicron变异株(B.1.1.529)首次在南非被发现[9],其超强的免

疫逃逸能力[10-11]和高传播力[12]导致疫情迅速蔓延到其他国家,并形成数百

个变异株(BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.13、BA.2.38、BA.2.75、BA.

3和BA.4/5等)[13]。OmicronBF.7(BA.)于2022年5月首次在比利时

被发现[14],BF.7是BA.5变异株的亚变异株,R346T独特的突变导致BF.7的免疫

逃逸能力进一步增强。根据中国疾病预防控制中心发布的SARS-CoV-2临床监测

数据报告,2022年北京市和天津市的主要流行株为BF.7,江苏省和内蒙古自治区

的主要流行株为BF.7和BA.5,其他省份的主要流行株为BA.5[15]。中国流行的

BF.7是一个独立的进化分支,具有3个独特的非同义突变,即开放阅读框7a(ope

nreadingframe7a,ORF7a):H47Y,非结构蛋白2(NSP2):V94L,S蛋白:C1243F,

根据Pangolin体系命名,确定为BF.7.14分支[16]。

本研究使用2022年12月收集的11份SARSCoV-2抗原初筛呈阳性的鼻咽拭

子样本进行病毒分离,Westernblot和间接免疫荧光法鉴定分离株,透射电镜观

察分离病毒的形态,并分析其序列和进化特征。