乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的检测.pptVIP

碱基变异可能导致：①原有位点消失②产生新的位点③识别位点移位利用错配引物使PCR产物中产生特异的酶切位点结果:酶切片段长、短变化和多、少变化聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)限制性内切核酸酶的作用它们能识别DNA的特异序列，并在识别序列内或其旁切割双链DNA。如：NdeI限制酶的识别序列和切割位点：CATATGGTATACNlaIll限制酶的识别序列和切割位点：CATGNNNGTACNNNPCR-RFLP检测HBVYMDD变异PCR错配引物设计PCR-RFLP检测HBVYMDD变异PCR-RFLP检测HBVYMDD变异简单、广泛易开展。优点：01限制性内切酶种类有限。错配引物将导致退火温度降低、非特异条带增多。引物非完全匹配，可能导致扩增效率降低、检测敏感的下降。缺点：02PCR-RFLP技术的评价反向杂交分析技术（INNO—LiPA）INNO—LiPA诊断HBVYMDD变异DNA芯片技术BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysisDNA芯片技术诊断HBVYMDD变异优点局限性01大通量技术和设备的要求高02快速检测成本高03灵敏度高04可平行检测05DNA芯片技术探针定点突变PCR技术Taqman-MGB探针引物末端碱基定点突变扩增技术高分辨熔解曲线法实时荧光定量PCR在基因变异中的应用Taqman-MGB探针定点突变PCR技术Taqman-MGB探针技术检测YMDD变异HBVDNA105copies/mlW:M=1:1HBVDNA105copies/mlW:M=10:1HBVDNA105copies/mlW:M=10:1：W：M040301优点不足特异性好需要多条荧光探针，成本高灵敏度高需要相对较贵的荧光PCR仪费时短影响因素多，存在一定误判02探针定点突变PCR技术引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术

检测YMDD变异熔解曲线法检测YMDD变异特异性探针，其Tm值不同溶解曲线分析基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)原理MALDI-TOFMS检测

HBVYMDD变异的原理酶切分子量.JPG基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)01优点：02高灵敏度、准确度、分辨率03能发现相对比例小于1%的变异株。04局限性：05设备昂贵，目前国内难以用于临床检测。INNO-LiPA法是一种反向分子杂交的方法,预先将多个特异性探针包埋在硝酸纤维素膜上,再与变性的DNA片段反向杂交,然后显色,最后根据探针特异核苷酸确定待测DNA片段的核苷酸序列。又称为基因芯片，DNA微阵列（DNAmicroarray)。指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。当病毒载量较高（HBVDNA105copies/ml）时，弱势株与野毒株比例相差不大时，优势株与弱势基本等效扩增，随着比例的不平衡的加剧，竞争抑制也越明显，当模板W:M=10:1时，检测结果显示W:M≌45:1，与实际情况相差较大。当病毒载量较低时（HBVDNA105copies/ml），弱势株可能被完全抑制。随着变异毒株在总病毒量中的比例逐渐增加，ΔCti-c及ΔCtv-c值也逐渐减小，检测结果基本反应了各模板的实际比例。脉冲激光照射到基质与样品混合物，基质吸收能量而爆炸，导致样品离子化。离子化的分子在强电场的作用下被加速，获得动能，然后沿飞行管无场区飞行。离子的质量与其飞行时间的平方成正比。故可通过测量离子在管中的飞行时间来求其分子量。在YMDD区上游引入一酶切位点，使得PCR产物可被酶切成片段，因其分子量不同，可被MALDI-TOFMS检测到。在拉米夫定治疗过程中，YMDD变异株一直存在。尽管出现YMDD变异意味着病