牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化(一.pdfVIP

牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在

大肠杆菌中的融合表达和纯化（一）

论文关键词：牙龈卟啉单胞菌菌毛大肠杆菌表达系统融合蛋白固

定化金属螯合亲和层析

论文摘要：研究背景：慢性牙周炎在我国有很高的发病率，严重影响国民

健康水平。慢性牙周炎不仅是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，而且还可能

是某些系统性疾病的危险因素。慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞

菌（Porphyromonasgingivalis，Pg）是其主要可疑致病菌。菌毛（fimbriae）

是Pg的重要致病因子，可介导Pg附着于口腔内各种组织细胞的表面，以有利于

Pg在体内进一步的粘附和侵袭；可引发炎症反应和免疫反应。并且菌毛具有良好

的免疫原性，可诱导机体的保护性免疫应答。目前，慢性牙周炎的治疗效果还不理

想，因此探索预防慢性牙周炎的有效途径具有重要意义。

研究目的：本研究拟在大肠杆菌中表达FimA蛋白并进行蛋白纯化。为后

续实验制备抗FimA蛋白的多克隆抗体提供实验基础。

研究方法：1.以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS为宿主菌，用IPTG诱导fimA

表达，通过SDS和Westernblot来验证蛋白的表达结果，并进行蛋白表达形

式分析。2.大量诱导表达融合蛋白，用Co2+柱亲和层析纯化表达产物，通过SDS-

PAGE和Westernblot来验证纯化产物，纯化产物经透析复性后用BCA法蛋白定量

试剂盒作蛋白含量测定。

研究结果：1.经IPTG诱导表达后，工程菌在SDS上出现一条新蛋

白带，分子量与预期大小基本一致（约41kDa），IPTG浓度及诱导时间对融合蛋白

表达量影响较大：当IPTG浓度为2mmol/L，诱导时间为3h时蛋白表达量最大；

当IPTG浓度为1mmol/L，诱导时间为1h时蛋白表达量最小。6×His-FimA表达

产物经SDS后，转移至硝酸纤维素膜，X线片感光，在X线片上相应位置呈

现阳性结果，可见一明显蛋白条带，而空质粒pET-15b对应位置未见特异条带。蛋

白表达形式分析结果表明表达的融合蛋白位于包涵体中。2.表达产物经Co2+柱亲

和层析，SDS上出现一致的单一条带，其分子量大小与预期相符（约

41kDa）。6×His-FimA纯化产物经SDS后，转移至硝酸纤维素膜，X线片感

光，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，条带位置与

BL21(DE3)pLysS全菌诱导表达后相应蛋白位置一致。经BCA法蛋白浓度定量试剂

盒对纯化后的蛋白质进行定量分析，计算出纯化后的FimA蛋白浓度为0.96

mg/ml。

主要结论：用本课题组前期构建的fimA基因的原核表达质粒pET-15b-

fimA，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后，fimA基因能够得到正确表达。

表达产物经Co2+柱亲和层析，可以得到带6×His标签的FimA融合蛋白。

1绪论

慢性牙周炎是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，在我国有很高的发

病率，严重影响国民健康水平。牙周炎造成的牙周组织的破坏是持续性的，一旦发

生，目前的治疗手段还不能使牙周组织达到完全的恢复。牙周炎还可能是某些系统

性疾病的危险因素。随着我国经济的发展、人民生活水平的提高和人群寿命的延

长，对牙周健康状况的关注日益提高。因此，探索预防慢性牙周炎的有效途径对于

提高国民健康水平具有重要意义。

疫苗在人和家畜疾病防治方面具有极大的作用，是一种有效的防治疾病的

手段。从减毒活疫苗、死疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗到DNA疫苗，由于技术不断

改进，使得疫苗有了广泛的应用，被成功的用于许多细菌或病毒感染的防治，因此

以疫苗来防治牙周炎也已成为一个重要思路。

慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas

gingivalis，Pg)是其主要可疑致病菌[1]。菌毛是Pg表面主要毒力因子之一，菌

毛蛋白(fimbrillin，FimA)是其主要亚单位，能够介导Pg对宿主组织的粘附与入

侵，以及与口内其他细菌的粘附共聚[1-3]，还能刺激炎性因子的产生[4]。多菌毛

Pg野生型菌株可引起定菌大鼠牙槽骨吸收，而无菌