真核基因在大肠杆菌中的表达.pptVIP

cI阻遏蛋白在42℃时失活，因此大肠杆菌在42℃培养时，PL启动子启动转录；而在28-30℃培养时，cI阻遏蛋白有活性，使PL启动子处于抑制状态，转录停止。01利用这一特性，我们只要简单地改变培养温度，就可以诱导或关闭PL启动子的活性。02将PL启动子克隆到质粒载体上，可以构建由PL启动子启动的表达载体。03BamHI,SmaI,EcoRI,XbaI,NcoI,SalIXhoI,SacI,HindIII第三节真核基因在大肠杆菌中的表达1.外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位细胞质中表达：易形成包涵体包涵体：由不可溶性蛋白聚集折叠形成，是外源基因高效表达时常发生的一种特殊生理现象。包涵体形成的理化参数：对E.coli80种蛋白研究获得。电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基的组分、半胱氨酸的组分、脯氨酸的组分、亲水性和氨基酸残基的总数。12分析蛋白质的氨基酸组分可以预测包涵体形成的概率。每种氨基酸出现在各种二级结构中的倾向或者频率不同。例如：Glu(谷aa)主要出现在?螺旋中Asp(天冬aa)和Gly(甘aa)主要分布在转角中Pro也常出现在转角中，但一般不会出现在?螺旋中优点：易于分离蛋白被保护而免受胞内酶的降解蛋白质没有活性，不会对寄主细胞造成伤害缺点：很难恢复生物学活性蛋白质的终产量低表达蛋白形成包涵体的优缺点：解决方案：限制包涵体的形成外源基因与分子伴侣共表达分子伴侣：能够阻止聚合作用而使蛋白质正确折叠。使用硫氧还蛋白缺陷的寄主菌株目的：维持有利的氧化还原电位低温诱导，降低蛋白质的合成速率与高可溶性的多肽融合表达优点：周质中细胞蛋白少，有利于外源蛋白的纯化。周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠。周质中蛋白质的降解作用小。01条件：需要信号肽的引导，使表达蛋白由细胞内膜转运到周质。信号肽：有原核的信号肽，也有真核的信号肽。02周质中表达蛋白质跨膜过程还与细胞的结构特征有关。01即使存在信号肽，也不能保证蛋白正确转运到周质中。02如：免疫球蛋白与T-细胞受体分子结构相似。03免疫球蛋白可以在周质中表达。04T-细胞受体不能在周质中表达。05蛋白转运过程相当复杂细胞外表达：易于分离纯化，但相当困难。原因：细菌细胞有两层膜，即内膜和外膜，表达蛋白需跨越两层膜屏障。解决方案：⑴利用大肠杆菌固有的途径：将外源蛋白与E.coli分泌型蛋白融合表达。增加E.coli细胞外膜的渗漏性：信号肽序列、透化剂、与细菌素释放蛋白或具透化作用的基因共表达。融合基因的概念：具有来自两个或两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。DNA体外重组构建的融合基因：外源基因与启动子融合：编码产物不一定是融合蛋白。两个或以上不同基因的编码序列组成的融合基因：编码产物为单一的多肽序列，称为融合蛋白、杂种蛋白、嵌合蛋白。2.融合蛋白的表达融合蛋白质配偶体作用：阻止包涵体的形成改善蛋白质的折叠性能限制蛋白酶的酶解简化蛋白质的检测与纯化程序种类：GST、His6、MBP等表达融合蛋白的策略用融合载体表达融合蛋白质：在设计时注意外源基因与靶基因连接后仍保持正确的读码框。BamHI,SmaI,EcoRI,XbaI,NcoI,SalIXhoI,SacI,HindIIIpGEX-KG5.0kbPtacBspMIBalIPstIAlwNINarIEcoRVBssHIIStopCodonsIGSTAmpLacIGAATTCTAGAEcoRIXbaI用融合载体组合表达融合蛋白质：在克隆外源基因时，不用考虑读码框问题。用pBR322质粒载体表达融合蛋白质pBR322质粒载体中含有唯一的PstI位点用末端脱氧核糖核苷酸转移酶和dGTP或dCTP进行同聚物加尾。G、C配对，T4DNA连接酶连接后，总有一部分具有正确的读码结构。GGGGGGGGGGGGGGGGCCCCCCCCCCCCCCCC利用与融合蛋白中的配偶体相对应的配体作为吸附剂，制备亲和层析柱。01通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白被滞留下来，其它蛋白则流出柱外。02通过洗脱处理，可回收到纯化的融合蛋白。03融合蛋白的纯化：真核基因在大肠杆菌中的表达琚春梅华南农业大学兽医学院微生物教研室2006-11-30基因与基因工程基因操作的主要技术原理基因克隆的酶学基础基因克隆的载体基因的分离与鉴定基因的表达与调节已讲述的内容讲述的内容提纲真核基因的大肠杆菌表达体系大肠杆菌的表达载体真核基因在大肠杆菌