基因诊断-肿瘤的分子诊断.ppt

核酸分子杂交的流程示意图杂交去除未参与杂交的探针检测杂交信号加入标记核酸探针滤膜上核酸固化待测核酸制备制备探针核酸片段探针标记基因组DNA探针cDNA探针寡核苷酸探针(Oligonucleotideprobes)RNA探针探针的种类探针的标记物32P，35S，125I，3H放射性标记物生物素，地高辛，荧光素，酶，金属非放射性标记物探针的标记方法放射性同位素标记法缺口平移法(Nicktranslation)随机引物延伸法(Randomprimerlabelling)末端标记法(Endlabelling)非放射性标记法酶促标记法、化学标记法SouthernblotNNTTNTTTraditionalMethods 01GAPDH-02PAP-03SouthernblotDay1Day2Day3Day4Day504单基因检测，不易发现表达基因间的相互作用05PCR特异性强灵敏度高操作简单、省时对待检原始材料质量要求低高效率的基因扩增技术PCR技术的优点PCR引物设计的一般原则引物长度01G+C含量02碱基分布的随机性03引物自身04引物之间05引物的3’端06引物的5’端07引物的特异性08PCR的种类通用引物PCR多重PCR套式PCRPCR结合寡核苷酸探针斑点杂交法PCR-RFLPAP-PCR原位PCR凝胶电泳点杂交微孔板夹心杂交法PCR-ELISA法PCR扩增产物分析法3.DNAsequencing4.DNA芯片技术

DNAchipsormicroarrayDNA芯片技术的概念由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）DNA芯片的分类（InsitusyntheticGeneChip）Affymetrix公司原位合成芯片（DNAmicroarray）斯坦福大学PatrickBrown研究小组DNA微集阵列壹贰01ATCGTCCAGTACT....原位合成芯片02寡聚核苷酸合成SyntheticChips03AffymexInc.密度大于1000/cm2合成DNA芯片显微光蚀刻AffymetrixInc.DNA微阵列DNA微集芯片StanfordUniv.PatrickBrown显微打印头单链DNA/cDNA片段MicroarrayPrintingDNA微集芯片.两类DNA芯片的比较内容原位合成芯片DNA微集阵列制备方式光引导原位化学合成收集探针、显微打印探针类型寡核苷酸cDNA、基因片段、寡核苷酸等探针长度短，小于30nt较长100nt~500nt或更长最高集成度10万~40万点阵/1万~10万点阵/平方厘米平方厘米专利保护专利控制严格无专利控制**DNA芯片技术原理大规模集成的固相杂交基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息DNA芯片技