化妆品原料抗氧化功效评价试验方法（征求意见稿）编制说明.docx

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T/LNPCXXX-2024

化妆品原料抗氧化功效评价试验方法

1范围

本文件规定了基于体外人皮肤模型的化妆品原料的抗氧化功效试验方法。本文件适用于具有生物学抗氧化作用的化妆品原料抗氧化功效试验。

本文件可作为化妆品原料抗氧化功效试验方法之一，对化妆品原料抗氧化功效进行评价。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

环境应激导致自由基的积累是皮肤衰老症状出现的重要原因之一。角质层过量的自由基积聚会使皮肤出现色斑、皱纹等问题。皮肤的氧化或过氧化损伤是皮肤衰老和美容的大敌，使皮肤抗氧化系统及天然抗氧化剂更好地发挥作用是皮肤美容的一个重要部分。

本文件检测加入化妆品原料后，计算人表皮角质形成细胞中核因子红细胞相关因子2（NRF2）相对H2O2对照组蛋白表达量的变化倍数，进而反映化妆品原料是否对皮肤有抗氧化功效。

5仪器及设备

5.1生物安全柜。

5.2倒置显微镜。

5.3CO2培养箱：37℃,95%相对湿度、5%CO2/空气。

5.4分析天平：精度0.1mg。

5.5微量移液器：5000μL、1000μL、200μL、20μL。

5.6垂直电泳槽

5.7电泳仪

5.8半干转膜仪

5.9凝胶成像仪

6试剂和耗材

6.1人表皮角质形成细胞（HaCaT细胞）

6.2DMEM培养基

6.3过氧化氢

6.40.25%胰蛋白酶（无菌）

6.5PBS磷酸盐缓冲液（无菌）

6.6WesternIP裂解液

6.7PMSF

6.8PAGE预制胶（Tris-Gly，12%）

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T/LNPCXXX-2024

6.9NR2RabbitPolyclonalAntibody

6.10GAPDHRabbitMonoclonalAntibody

6.11辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG

6.12ECL化学发光试剂盒

6.13Western半干法转膜液

6.14PVDF膜

6.15转印滤纸

6.16一抗稀释液

6.17二抗稀释液

6.18电泳封闭液

6.19电泳洗涤液

7试验步骤

7.1体外模型的准备

7.1.1细胞培养

将人角质形成细胞用胰蛋白酶作用5min-10min后，用专用培养基终止消化，巴氏吸管吹打细胞使其成为单细胞悬液。加入适量培养基稀释细胞悬液使其密度约为1×104个/mL。用微量移液器吸取细胞悬液以2mL/孔接种到35mm培养皿中，然后置于CO2培养箱培养48h。

7.1.2给予化妆品原料

待细胞生长到融合度为80%-85%时，即可试验。试验设置空白对照组、H202对照组和化妆品原料组。称取一定量的化妆品原料，化妆品原料浓度：通过细胞毒性检测确定化妆品原料的浓度范围。

将其用培养基稀释到试验浓度。用微量移液器吸干平皿内的培养基；加入2mLPBS清洗细胞一次，再吸干各孔。空白对照组每孔加入2ml空白培养基、对照组每孔仅加入1mL空白培养基，化妆品原料组每孔加入1mL含有化妆品原料的培养基。

7.2H2O2刺激

H2O2用培养基稀释至50μg/ml，对照组和化妆品原料组每孔加入1ml，摇匀，继续培养4h。

7.3样品收集处理

培养4h后，吸掉培养液，加入1mlPBS清洗细胞1次，再吸干各孔。每孔加入300μl裂解液，收集裂解物至1.5mlEP管中，13000g/min离心5分钟，收集上清，用WesternBlotting检测Nrf2的蛋白表达水平。

7.4试验步骤

7.4.1样品加入5×loadingbuffer，混合均匀，95℃水浴加热5min，13000g/min离心5min，收集上清。

7.4.2垂直电泳，Marker上样5μl，样品上样60μg/孔。

7.4.3浓缩胶电泳条件：80V；分离胶电泳条件：120V。

7.4.4电泳结束后，取出凝胶，进行半干式转印至PVDF膜上，转印条件为20V，45min。

7.4.5转印结束后，取出PVDF膜加入封闭液封闭5min。

7.4.6按照目标蛋白和内参蛋白的分子量将膜裁剪成两半，然后分别放入用一抗稀释液稀释的Nrf2RabbitPolyclonalAntibody（1:1000）和GAPDHRabbitMonoclonalAntibody（1:1000）中室温振荡孵育1h。

7.4.7取出PVDF膜，加入洗涤液中，室温振荡洗涤3次，每次5min。

7.4.8取出PVDF膜，加