二代测序技术在医学领域中的应用.pptVIP

二代测序应用医疗的可行性NGS的优势相比于一代测序，NGS更加省时低成本，速度快，覆盖度深，准确度高；高通量测序人类基因组有助于发现与疾病相关的未知基因；对于疾病引起的基因突变，高通量测序可以为患者医师提供更为准确的诊断依据；需求样本类型广泛，样本量需求少。全基因组重测序（WGRS）全外显子组测序（WES）寻找个体突变，InDel，CNV，SV等等，需求数据量大，单个样本需求90G数据。捕获基因组中的全外显子进行测序，测序数据量较WGRS少很多，并能获得高测序深度（50X-150X）常见医学领域NGS方案捕获富集感兴趣的靶向区域进行测序，技术流程与全外显子捕获相似，测序需求量较WES少，能获得更高测序深度（最高500X）靶向区域测序（TargetSequencing）研究转录水平上的测序，包括mRNA，lncRNA，microRNA等。转录组测序（RNA-Seq）常见医学领域NGS方案全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。全基因组重测序(WGRS/DNA-Seq)SNP（个体间差异）CNV（大片段基因拷贝数变异）InDelSV（结构变异）全基因组重测序的应用SNP(SNV)示例SNP目前已被公认为疾病发生的基因分子标记。01SNP分布广泛，且较为稳定。03SNP被认为是导致药物差异化的主要因素之一，因此可以根据SNP的变化来进行个性化用药。02某些SNP会直接影响功能基因表达。04为何研究SNP？大多数的SNP都是无用的大多数的SNP属于沉默突变。非编码区的错义突变也不会导致蛋白质发生改变。但也有例外诊断实例：Dr.JamesGern和JosephDeRisi合作，用MiSeqDx从一个病危的十几岁的男孩的脑脊液中抽提出核酸样本，测了8百万条核酸序列，从中检出了475条钩端螺旋体的序列，从而判定这个男孩的病是因为钩端螺旋体感染。Dr.JamesGern依据上述的判断，给男孩青霉素治疗，治好了这个男孩的病。脑脊液是较难取得的体液，只能是采集很少的量，这就限制了所能得到的核酸总量。钩端螺旋体，在病原体的常见程度排名中是较靠后的种类。在本案例中，如果用PCR方法，挨个排查病原体，可能还没排到钩端螺旋体，核酸就不够了。但高通量测序克服了核酸量不够的问题。在本案例中，钩端螺旋体DNA只占总DNA的万分之0.6，含量极微，但经过高通量测序，得到了475条钩端螺旋体的DNA，这让钩端螺旋体无处循形。2009年H1N1病毒爆发感染时，有一名病人死于呼吸系统引起的多器官衰竭，然而并不知道具体的死因。科学家把病人的肺部穿刺组织的DNA拿来做高通量测序。最终在950万条序列中，含有0.85%的序列来自于H1N1病毒基因组，从而帮助科学家发现了该病人的真正死因。在这样高人类基因组干扰的背景下，目前其他技术都难以快速发现致病病毒序列、以及分子分型。Kuroda,M.,Katano,H.,Nakajima,N.,Tobiume,M.,Ainai,A.,Sekizuka,T.,…Sata,T.(2010)..PloSOne,5全外显子测序（WES）Nimblegen(Roche)SureSelect(Agilent)RNAOligoTrusight(Illumina)癌症相关（人）01遗传性疾病（人）02其它非传染性疾病（人）03主要用于寻找罕见突变，遗传性突变及癌症相关的体细胞突变04可以做SNP，InDel分析，但由于捕获区域较短，一般不用于CNV，SV分析。05WES应用领域成本低（一般50-150X，也仅需要8-15G数据）1降低分析背景，容易发现稀有突变。2大约能测到50-80bp的片段缺失，由于外显子捕获芯片片段较短，很难判断是由捕获脱靶导致还是由缺失导致。3同样因为捕获芯片片段较短，一般不做CNV，SV分析。4WES特点WES方案流程包括mRNA-Seq，lncRNA-Seq，sRNA-Seq等。可以高通量分析转录本信息，发现未知的转录本和基因注释。寻找个体间，同一个体不同时期等感兴趣基因表达丰度变化。转录组测序(RNA-Seq)mRNA-Seq方案有关lncRNA的一些知识：长度大于200bp无法编码蛋白有内