医学分子生物学技术.ppt

凝胶过滤的分配系数**K=(Ve-V0)(Vi)主要凝胶过滤介质的牌号及骨架结构葡聚糖凝胶(G)**型号分离范围(分子量)吸水量(克／克干凝胶)膨胀体积(毫升／克干凝胶)浸泡时间蛋白质多糖20～25℃90~100℃107007001.02-33115150015001.52.5-3.531251000-5000100-50002.54-631501500-30000500-100005.09-1131753000-700001000-500007.512-152431004000-1500001000-1000001015-207251505000-4000001000-1500001520-307252005000-8000001000-2000002030-40725亲和层析：利用生物分子间特殊的亲和关系进行的分离方法。是蛋白质分离纯化的最有效的方法之一，有时甚至可以仅用一步纯化即可达到纯化目的。只要被分离蛋白、配基和载体之间能形成以下的关系，即可进行亲和层析**基本原理：亲和层析法利用了生命现象中生物分子之间非常特异的相互作用而进行分离纯化的方法。生物体内能发生特异的相互作用的成分有：酶与酶的底物酶与酶的抑制剂酶与酶的变构效应剂酶与酶的辅酶激素与细胞膜上的受体维生素与结合蛋白核酸抗原与抗体外源凝集素与红细胞表面的抗原回收率高**特异性强分辨率高层析柱的再生方便亲和层析特点特别适用于微量生物活性物质的分离蛋白质的电泳分离**电泳是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象正极负极带负电粒子带正电粒子**++++++++--------++++++++--------蛋白质胶体颗粒的沉淀带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质酸酸碱碱脱水脱水脱水不稳定的蛋白质颗粒（沉淀）带正电荷的蛋白质（疏水胶体）带负电荷的蛋白质（疏水胶体）碱酸（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）电泳原理：**F’=6πrηvF=EQ带电颗粒在电场中所受到的电场力根据Stoke定律，球形分子在液体中泳动所受到的阻力F=F’即：EQ=6πrηv时，V=EQ6πrη当物质在电场中移动时，受到电场力和液体阻力两方面的力的影响，当电场力和阻力平衡时，带电颗粒作匀速运动，U==**两个带电颗粒能否分开，由两个颗粒在电泳过程中的迁移率所决定，即U=dlVt或d=UVtldVEtVl=dlVt或d1-d2=(U1-U2)VtlΔd=迁移率（或泳动度）是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度，可用下列公式计算：Ｕ=υ/E=(d/t)/(V/l)=dl/VtＵ为迁移率（cm2·V-1·min-1）；υ为颗粒泳动速度（cm·s-1）；E为电场强度（V·cm-1）；d为颗粒泳动的距离（cm）；l为滤纸有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为通电时间（s或min）。通过测量d,l,V,t,即可计算出被分离物质的迁移率。影响电泳的因素**带电粒子的性质与电泳行为电场强度对带电粒子迁移的影响：电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对泳动速度起着十分重要的作用。一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。溶液的pH对带电粒子迁移的影响：溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少。电渗对电泳的影响：电渗是在电场中液体对固体的相对移动。电渗作用**离子强度对电泳的影响：电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降低，原因是带电的离子会吸引相反符号的离子聚集在其周围，形成一个与运动粒子符号相反的离子氛，它使该离子向相反的方向运动，从而降低了该粒子的迁移率。温度对的电泳的影响：01电泳过程中由于通电产生焦耳热，热对电泳有很大的影响。02温度每升高1℃，迁移率约增加2.4%。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，或在电泳系统中安装冷却散热装置。03电泳的分类和特点**电泳的分类01自由移动界面电泳02区带电泳03