抗肿瘤药物筛选.pptVIP

3.细胞凋亡通路靶点01细胞周期调控靶点02与侵袭相关的靶点03耐药相关的分子靶点04靶点选择原则：特异性、有效性、综合性、个性化*鸡属卵生动物,胚胎在卵中发育。当卵子由葡萄状的卵巢排出时，正处于减数第二次分裂的中期阶段。然后卵子进入输卵管并下移，如果遇到精子，受到精子入卵的影响，即完成第二次减数分裂，放出第二极体并完成受精，所形成的合子在输卵管中还要经过２４－２７小时的发育。在如此长的时间内，合子已发育到了囊胚阶段甚至原肠胚早期阶段。此时的白色圆盘较大叫做胚盘。在进行上述发育过程的同时，鸡卵由输卵管前部逐渐后移，包上由输卵管分泌蛋白形成的卵白和壳膜，并在子宫内包上钙质壳后排到体外以实验部位边缘1mm范围内为一级血管,实验部位边缘5mm处为二级血管,对新生血管进行计数比较可用于促血管新生药物的评价和筛选。鸡胚有4层胚膜(卵黄囊膜、羊膜、浆膜、尿囊膜)和2套血管网(卵黄囊血管网、尿囊膜浆膜血管网)。鸡胚尿囊出现在孵育的第3．5d，在孵育4～10d．尿囊腔迅速增大至胚外体腔并包围羊膜．以后尿囊外壁与绒毛膜紧贴形成尿囊绒毛膜中胚层的双层结构由绒毛膜和尿囊膜组成．在这两层中形成丰富的血管网。不成熟的血管散在分布于中胚层．直到第8d形成毛细血管丛．覆盖在绒毛上皮细胞表面。毛细血管快速增殖持续到第11d．此后内皮细胞有丝分裂指数迅速下降．到第18d，血管系统最终形成。鸡胚孵化至第8d时．胚膜和血管网的发育已趋稳定，而机体免疫系统尚未完全建立．此时对各种异物几乎不产生排斥反应．便于观察各种诱导剂和抑制剂对血管生成的影响。早期鸡胚的血液循环有3条主要路线，即卵黄囊血液循环、尿囊绒毛膜血液循环和胚内循环。*抗肿瘤药物筛选侯桂琴郑州大学药学院利用分子靶点筛选细胞筛选动物模型微生物学筛选方法基因芯片技术精原细胞法内容提要一细胞筛选筛选方法四氮唑蓝（MTT）还原法原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值123实验组光吸收值（A）细胞存活率=×100%对照组光吸收值（A）可用细胞存活率对剂量作图求出IC50值1应用：生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。2特点：灵敏度高、经济。3缺点：产物不溶于水，需被溶解后才能检测。步骤：步骤：（1）制备单细胞悬液；(2)对细胞计数后接种于96孔板，一般5000个/孔（可先做细胞倍增试验确定每孔中最佳细胞数）；（3）将培养板放入CO2培养箱，过夜培养；（4）24h后更换培养基，并在每孔细胞中加入不同浓度药物，继续培养；（5）24或48h以后，加入MTT溶液，再培养3-6h,停止培养，弃取培养基,加入DMSO，每孔150ul，轻微震荡混匀；（6）把96孔板放入酶标仪中，490nm测定吸光度。注意：设好对照CCK-8法01注意：适合贴壁细胞，细胞要分散均匀，操作要柔和。2.集落形成法：02特点：悬浮细胞较方便，贴壁细胞要进行消化，此步误差大。3.台盼蓝排斥试验二微生物学筛选方法(抗肿瘤抗生素)噬菌体法细菌变种法抗代谢法噬菌体法噬菌体：是一类能感染微生物的病毒抗噬菌体法：干扰DNA代谢的抗生素如放线菌素、博来霉素常能抑制噬菌体在细菌细胞内的生长，从而不产生噬菌体颗粒而出现抗噬菌体的现象。01溶原性菌诱导法：除烈性噬菌体外，还有一种噬菌体，其基因组直接螯合到细菌染色体DNA，不复制，因其大部分基因功能受到了“阻遏物”阻抑，这种带前噬菌体的菌株称温和性或溶原性菌。但是当“阻遏物”的量由于细胞内或环境因子（物理、化学）而降低时，溶原性就不能维持，前噬菌体开始生长，是细菌裂解，称为诱导作用。一些抗肿瘤抗生素有诱导能力。02细菌变种法人工培育变种如:使细菌模仿肿瘤细胞的某些代谢特点使细菌对核酸或蛋白合成抑制剂敏感检测突变作用如:依赖链霉素的菌株3.抗代谢法抗代谢物在无机氮源的合成培养基中显示抗菌作用，而在普通有机氮源的营养培养基中无抗菌作用（因为有机氮源可将具有抗菌作用的物质代谢），利用此特点，选择无机氮源试验有抗菌作用的物质，作为抗代谢的初筛方法。(抗生素和植物药)建立依据三精原细胞法01实验方法及判定22－28g雄性小鼠，药物直接注入睾丸，不同浓度，每一浓度用2－3只，注射3天，处死动物，睾丸固定，石蜡包埋切片，苏木精－伊红染色，显