化妆品原料防晒功效评价试验方法（征求意见稿）编制说明.docx

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T/LNPCXXX-2024

化妆品原料防晒功效评价试验方法

1范围

本文件规定了基于体外人皮肤模型的化妆品原料的防晒功效试验方法。本文件适用于具有生物学防晒作用的化妆品原料防晒功效试验。

本文件可作为化妆品原料防晒功效试验方法之一，对化妆品原料防晒功效进行评价。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

防晒对于维持胶原蛋白的健康和皮肤弹性至关重要。日光中的紫外线（UVA波段）可以直达肌肤的真皮层，促进胶原蛋白的降解、抑制其合成，并通过引发氧化应激损伤胶原蛋白。使用防晒产品可以有效减少紫外线引发的伤害，保护胶原蛋白免受降解，促进其合成，并减少光老化的发生。防晒不仅是预防皮肤癌的有效手段，也是保护皮肤胶原蛋白、延缓衰老的关键措施。

本文件检测加入化妆品原料后人真皮成纤维细胞中胶原蛋白表达量的变化，进而反映化妆品原料是否对皮肤有防晒功效。

5仪器及设备

5.1生物安全柜。

5.2倒置显微镜。

5.3CO2培养箱：37℃,95%相对湿度、5%CO2/空气。

5.4低温高速离心机。

5.5酶标仪：450nm、630nm。

5.6分析天平：精度0.1mg。

5.7微量移液器：5000μL、1000μL、200μL、20μL。

5.8紫外灯（UVA波段）：320～420nm。

5.9紫外线照度计（UVA波段）。

6试剂和耗材

6.1人皮肤成纤维细胞（HSF细胞）。

6.2HSF细胞专用培养基。

6.30.25%胰蛋白酶（无菌）。

6.4PBS磷酸盐缓冲液（无菌）。

6.5人I型胶原蛋白ELISA检试验剂盒。

7试验步骤

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7.1体外模型的准备

7.1.1细胞培养

将人真皮成纤维细胞用胰蛋白酶作用5min-10min后，用专用培养基终止消化，巴氏吸管吹打细胞使其成为单细胞悬液。加入适量培养基稀释细胞悬液使其密度约为1×104个/mL。用微量移液器吸取细胞悬液以3mL/孔接种到6孔板中，然后置于CO2培养箱培养48h。待细胞密度达到1×105个/mL，即可给予化妆品原料。

7.1.2UVA刺激

待细胞生长到融合度为80-85%时，UVA紫外灯以2500mJ/cm2照射剂量照射细胞，空白对照组不做照射处理。

7.2给予化妆品原料

试验设置空白对照组、光照对照组和化妆品原料组。称取一定量的化妆品原料，将其用成纤维细胞专用培养基稀释到试验浓度。用微量移液器吸干6孔板内的培养基；加入2mLPBS清洗细胞一次，再吸干各孔。空白对照组、光照对照组每孔仅加入2mL培养基，化妆品原料组每孔加入2mL含有化妆品原料的培养基。随后将6孔板置于CO2培养箱中继续培养24h。

7.3样品收集处理

照射后，紫外对照组加入专用培养基，化妆品原料组加入不同浓度的化妆品原料溶液，继续培养24h，收集细胞培养液，并以CCK-8法测定细胞活力，收集的细胞培养液用Elisa试剂盒测定Ⅰ型胶原蛋白的含量。

7.4试验步骤

7.4.1从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条。

7.4.2设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

7.4.3样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

7.4.4除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37°C水浴锅或恒温箱温育60min。

7.4.5吸干每孔液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，吸干洗涤液，将板在吸水纸上拍干，如此重复5次。

7.4.6每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.4.7每孔加入终止液50μL。

7.4.8取出96孔板，酶标仪检测。

7.5测定条件

在450nm波长测定吸光度，用630nm波长作为参考波长进行双波长测定，计算蛋白样品浓度。

8结果计算

在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

dc=(()?1)×100%···············································(1)

式中：

dc——样本含量变化率，%；

X——化妆品原料组I型胶原蛋白含量的平均值；Y——光照对照组I型胶原蛋白含量