实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团.ppt

ContentLayoutsContentLayoutsContentLayoutsContentsClicktoaddtitleinhere123实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的方法介绍实时荧光定量PCR的应用实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。与普通PCR的区别普通PCR技术实时定量PCR技术在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性。Ct值的定义：扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。Ct值定量PCR的数学原理?理想的PCR反应：X=X0*2n?非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)最后结论：LogX0与Ct呈线性关系，根据样品扩增的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。

Log起始拷贝量与Ct呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。标准曲线

实时荧光定量PCR的方法介绍

DNA产物的荧光标记非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记：2、TaqMan3、MolecularBeaconSYBRGreen法工作机理SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光。变性时，DNA双链分开，无荧光。在延伸结束阶段采集荧光信号。SYBRGreen也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析。

SYBRGreen熔解曲线分析

融解曲线分析，单一峰，无非特异性荧光，定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确SYBRGreen法优缺点优点缺点对DNA模板没有选择性--适用于任何DNA使用方便--不必设计复杂探针非常灵敏便宜容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性，但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高TaqMan法5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号

TaqMan法PCR反应的建立

引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-60℃反应参数的确定：一般为：95℃,3min、94℃，15S、60℃，60S（Taq酶5′→3′外切酶活性在60℃最高也可通过温度梯度优化退火温度）优化引物和探针浓度：引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM其他与常规PCR相同TaqMan法优缺点优点缺点对目标序列的高特异性--阴性结果确定引物设计相对简单重复性比较好只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高荧光定量PCR技术的应用绝对定量基因表达研究转基因食品检测相对定量基因在不同样本中的表达差异药物疗效考核阴阳性分析病原体（HBV，HCV等）检测禽流感检测等位基因分型SNP分析与疾病相关的等位基因点突变检测拓展应用MicroRNA分析基因拷贝数分析表观遗传学分析蛋白质分析肿瘤稀有突变检测ContentLayoutsContentLayoutsC