生物制药--基因工程.ppt

④消沫装置⑤取样装置⑥旋转搅拌装置⑦进料系统----培养基加入口。⑧排出系统----气体排出+冷却水排出+废料排出。（2）发酵罐的要求总体要求：（A）保证发酵环境条件恒定，（B）不影响其遗传特性，（C）不能引起所带质粒丢失。具体要求（A）提供菌体生长的最适条件，（B）培养过程不得污染，（C）保证纯菌培养，（D）培养及消毒过程中不得游离出异物，（E）不能干扰细菌的代谢活动。（F）发酵罐应当用不锈钢制成，表面光洁，没有灭菌死角。（G）任何接口必须用密封圈，不得存在泄漏，（H）为了避免基因工程菌在自然界扩散，培养液废物必须经过杀灭处理之后才能进行排放。以免基因污染。第八节高密度发酵高密度发酵工艺：又称高密度发酵技术，是在传统发酵技术上改进的发酵技术，它采用增加工程菌对数期的生长时间、相对缩短衰亡时间来提高菌体的发酵密度，极大地改进了发酵工艺，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)，不仅可减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期,减少设备投资从而降低生产成本，极大地提高了在市场上的竞争力。一、影响因素1、培养基的选择培养基分为天然、组合和半组合培养基3种。高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物,一般使用的培养基为半组合培养基。培养基各组分的浓度和比例要恰当,过量的营养物质反而会抑制菌体的生长,特别是碳源和氮源的比例。2、接种量接种量的大小直接影响发酵周期。接种量小(0.5%～4%)时,比生长速率大,对数生长期持续时间长;接种量大(8%)时,细菌较快地达到了稳定期,持续生长时间短,自溶也较快,所以接种量一般选择在4%以下。3、溶氧浓度溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大，溶解氧的浓度过高或过低都会影响细菌的代谢。在高密度发酵过程中提高溶氧量的方法主要有：增大搅拌转速；增加空气流量以增加溶氧量；通入纯氧来提高氧的传递水平；培养基中添加H2O2，利用宿主菌的过氧化氢酶分解产生O2；提高氧的分压。4、pH值稳定的pH值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件。在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸和CO2,可使pH值显著降低。所以发酵工程中必须及时调节pH值使之处于适宜的pH值范围内,避免pH值激烈变化对细胞生长和代谢造成的不利影响。通常用于控制pH值的酸碱有HCl、NaOH和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有补充氮源的作用。5、培养温度培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素。较高的温度有利于细菌的高密度发酵,低温培养能提高重组产物的表达量。一般大肠杆菌的最适生长温度是37℃,而质粒稳定温度和目标蛋白的诱导温度大多为30℃。对于采用温度调控基因表达或质粒复制的重组菌,发酵过程一般分为生长和表达两个阶段,在不同培养阶段采用不同的培养温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量,并可缩短培养周期。但较高的温度会导致包涵体的形成,不利于后期的纯化处理;同时,也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重组蛋白量。6、诱导剂及诱导时间控制浓度较低时，外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高而不断升高；当浓度超过一定限度时，就会影响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。7、代谢副产物高密度发酵过程中,细菌代谢产物CO2的积累也会抑制外源蛋白的表达。因为CO2对菌体具有直接的毒害作用,而且溶解于发酵液中也会导致pH值的下降。以葡萄糖为碳源的大肠杆菌的生长,常伴随着乙酸的分泌,进而影响细胞生长和蛋白表达。当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳生产所需量或在缺氧的条件下便会产生大量的乙酸。二、实现高密度发酵方法主要有：(1)适宜宿主的选择；(2)重组蛋白积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定；(3)重组基因最大表达的分子策略；(4)细胞生长和生产环境的优化；(5)发酵条件的优化；(6)后处理过程的优化。

第九节基因工程药物的

分离纯化（一）工程细菌所表达出蛋白质的特点1、目的产物在初始物料中含量很低。2、初始产物的组成十分复杂。除了目的蛋白质之外，还含有残余细胞、代谢产物、残余培养基、各种无机盐。3、目的蛋白质的稳定性很差，容易失活、变性，对于温度、PH、金属离子、有机溶剂十分敏感和脆弱。4、目的蛋白质的种类繁多，存在着大小不同的片段。5、纯度不高、常常含有杂菌、热原等等物质。（二）分离纯