PCR产物电泳结果分析.pdf

产物检测时间

一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚

至消失.

假阴性,不出现扩增条带：

PCR反应(de)关键环节有①模板核酸(de)制备,②引物(de)质量与特

异性,③酶(de)质量及,④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行

分析研究.

模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中

蛋白质没有消化除净,特别是染色体中(de)组蛋白,④在提取制备模板时

丢失过多,或吸入酚.⑤模板核酸变性不彻底.在酶和引物质量好时,不出

现扩增带,极有可能是标本(de)消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因

而要配制有效而稳定(de)消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改.

酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶(de)活

性丧失或不够而导致假阴性.需注意(de)是有时忘加Taq酶或溴乙锭.

引物：引物质量、引物(de)浓度、两条引物(de)浓度是否对称,是PCR

失败或扩增条带不理想、容易弥散(de)常见原因.有些批号(de)引物合成

质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率(de)不对称扩

增,对策为：①选定一个好(de)引物合成单位.②引物(de)浓度不仅要看OD

值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两

引物带(de)亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做

PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决.如一条引物亮度高,一条亮

度低,在稀释引物时要平衡其浓度.③引物应高浓度小量分装保存,防止多

次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效.④引物设计不合

理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等.

2+2+

Mg浓度：Mg离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR

扩增(de)特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不

出扩增条带.

反应体积(de)改变：通常进行PCR扩增采用(de)体积为20ul、30ul、

50ul.或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目

(de)而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要摸索条件,否则

容易失败.

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,

极有可能出现假阴性；退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩

增效率退火温度过高影响引物与模板(de)结合而降低PCR扩增效率.有时

还有必要用标准(de)温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内(de)变性、退火

和延伸温度,这也是PCR失败(de)原因之一.

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,

或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功

(de).

假阳性

出现(de)PCR扩增条带与目(de)靶序列条带一致,有时其条带更整齐,

亮度更高.

引物设计不合适：选择(de)扩增序列与非目(de)扩增序列有同源性,

因而在进行PCR扩增时,扩增出(de)PCR产物为非目(de)性(de)序列.靶序

列太短或引物太短,容易出现假阳性.需重新设计引物.

靶序列或扩增产物(de)交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基

因组或大片段(de)交叉污染,导致假阳性.这种假阳性可用以下方法解决：

①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外.②除

酶及不能耐高温(de)物质外,所有试剂或器材均应高压消毒.所用离心管

及样进枪头等均应一次性使用.③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫

外线照射,以破坏存在(de)核酸.二是空气中(de)小片段核酸污染,这些小

片段比靶序列短,但有一定(de)同源性.可互相拼接,与引物互补后,可扩

增出PCR产物,而导致假阳性(de)产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除.

出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现(de)条带与预计(de)大小不一致,或大或小,或者同时

出现特异性扩增带与非特异性扩增带.非特异性条带(de)出现,其原因：一