基因工程3大肠杆菌表达系统.pptVIP

Talmadge和Gilbert（1982）将外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的不同部位表达。结果：细胞质中表达的大鼠胰岛素原的半衰期仅有2min左右，而表达在大肠杆菌周质中大鼠胰岛素原的半衰期延长了10倍以上。（原因：细胞周质中蛋白酶的含量低）01到目前为止，这方面的技术还很不成熟，外泌率低。02使克隆基因表达的外源蛋白质分泌到胞外的培养基中，是获得蛋白质稳定性的最佳途径。03影响因素包括：外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性当一种克隆的外源基因在大肠杆菌中不能实现其功能表达时，我们往往会认为这是由于转录或翻译过程发生了问题。其实在早期的研究中就有许多实验表明，克隆的外源基因即便是在大肠杆菌中得到了表达，也并不一定就意味着它的多肽产物是稳定的。0102蛋白质的降解作用在大肠杆菌的细胞中，含有大量的各种类型的蛋白酶，广泛分布在细胞质、周质、内外膜等部位，参与许多方面的代谢活动，包括选择性地酶解异常的蛋白质。已知有许多因素，如不完全多肽、氨基酸取代突变、多酶复合体亚基的超量合成、氧化作用或游离自由基的作用而造成的翻译后损伤，以及基因工程技术的效应等，都可以导致蛋白质分子受损或构型变化，形成异常蛋白质。01021）让外源蛋白质定位在周质或胞外表达；2）使用蛋白酶缺陷的大肠杆菌做表达菌株；3）将转化有克隆基因的寄主菌株放置在低温环境中生长；4）使目标基因以融合蛋白形式表达；5）置换多肽链中某些氨基酸，消除蛋白酶切点；6）对目标蛋白质作疏水性修饰。为了避免在大肠杆菌中发生外源蛋白质的降解，或将此降解作用控制在最低水平，已针对性发展出了许多种不同的技术方案。主要有：结构决定因子与蛋白质的稳定性不清楚?但已经明确了若干种影响蛋白质稳定性的结构决定因子。其中最重要的：N-端氨基酸性质。?与蛋白质稳定性相关的确切的分子结构特征？0102030405“N-端法则”:在生物体内蛋白质新陈代谢的稳定性，主要取决于N-端氨基酸的性质。在大肠杆菌细胞质内，若蛋白质N-端为Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr和Trp等残基，则其稳定性较差；而同样条件下，若N-端为除了前述6种氨基酸之外的其它任何一种氨基酸残基时，其稳定性则大大提高。重组操作时，N-端增加一个增加稳定性的氨基酸12N-端氨基酸性质1表达天然的蛋白质2以形成融合蛋白的形式在大肠杆菌细胞中表达外源真核基因具有许多方面的优越性。例如，产物比较稳定，可以免受胞内蛋白酶的降解作用，可以获得较高的产率。3Tacon等人在80年代初期，使用大肠杆菌的trp启动子和与之相连的SD序列，构建了两种有利于表达天然蛋白质的质粒载体。pWT551和pWT571分子伴侣（molecularchaperone）稳定作用分子伴侣：指一类多功能蛋白质，它能够通过阻止诸如聚合作用这样的副反应，来促使其它蛋白质按正确的方式折叠，而其本身却不是最终形成的功能蛋白质的组成成分。通过分子伴侣与克隆的外源基因在大肠杆菌寄主细胞中共表达是增强目标蛋白的稳定性、实现高水平表达的有效方法。大肠杆菌突变体菌株与蛋白质的稳定性通过产生融合蛋白途径增加外源多肽稳定性的方法，已有许多文献报道，但此法的一个突出缺点是所产生的融合蛋白并不一定都能够在体外将天然蛋白质完整无损地切割下来。一种相当有效的变通办法是，使用胞内蛋白酶含量很低的大肠杆菌突变株，作为表达外源蛋白质的寄主细菌。其中用得最多的是缺失lon蛋白酶的大肠杆菌突变株。影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞生理特征等都会不同程度地影响克隆基因的表达效率。1、启动子对克隆基因表达效率的影响(1)启动子结构对表达效率的影响大肠杆菌启动子的序列结构具有两个保守序列，即-35区（5’-TTGACA）和-10区（5’-TATAAT），后者又叫Pribnow盒。应用半乳糖激酶系统检测结果表明：启动子序列与上述保守序列之间相似程度越高，其表达能力也就越强，两者呈正比关系。此外，两个保守序列之间的距离也影响克隆基因的表达效率，这段间隔距离越接近于17个碱基，启动子的活性就越强。启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响Roberts等用?plac5.1DNA的含有lac启动子和SD序列与?cro基因表达序列构建了不同间隔距离的重组质粒载体。从中挑选了9种不同的重组质粒载体，分别转化大肠杆菌细胞，然后测定各种克隆所产生的cro蛋白质含量，同时也对每种质粒中的连接lac-cro基因的结合区序列进行测定。容易出现转录过头，影响表达效率。需要使用强的转录终