肿瘤细胞培养技术-林星石.pptVIP

免疫方法添加标题脾内免疫方法：添加标题号针头注射器注入脾脏，尽量刺深，勿刺添加标题BALB/C小鼠乙醚麻醉，右卧位，消添加标题透，纵轴方向，边退边注射或多点注射。添加标题毒，无菌操作剪开皮肤，透过腹膜，用4添加标题注意事项：添加标题抗原体积?0.2ml，脾内逐步注射后，添加标题针头拔出口时要停留片刻，缝合切口或用添加标题医用黏合剂涂抹切口。免疫方法.弱免疫原免疫方案；天：基础免疫天：基础免疫天：基础免疫天：基础免疫天：基础免疫6个月内，至鼠血清测出抗体产生。静脉或脾内追加免疫后72~96h细胞融合。免疫方法RPMI1640培基，加适量滋养细胞与抗原（可溶性抗原0.5~5?g/ml；细胞性抗原分离小鼠脾细胞，置10%~20%FCS5~106/ml），37℃，5%CO2培养3天，再分离淋巴细胞与骨髓瘤细胞，融合。添加标题添加标题添加标题添加标题添加标题体外免疫：单克隆抗体制备一种或几种生长因子，提供必要生长条件。小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞正常无感染BALB/C小鼠，处死。75%乙醇浸泡5~10min，一.滋养细胞制备：机制：不明，通常认为这类细胞释放单克隆抗体制备撕开腹部皮肤，充分暴露腹腔，提起腹膜，剪开，吸管注入5ml无血清培基，小心提动或轻揉腹膜，吸出培基。无血清培基洗2次，细胞浓度2×105/ml,0.1ml/孔/96孔，相当于2×104。通常获2×106~5×106只。单克隆抗体制备骨髓瘤细胞准备：Sp2/0,NS-1等复苏，20%FCSRPMI-1640培基为好。培养、传代，取对数生长期细胞（1×105~5×105/ml），按1：5~1：10稀释传代，2、3天扩大培养，选生长状态、形态好对数生长期细胞融合用。RPMI-1640培基洗3次（1000r/min×5min)单克隆抗体制备注意事项：骨髓瘤细胞的细胞活数应在〉95%，无各种污染，骨髓瘤细胞质量保证、生长密度合适。肿瘤细胞培养技术

解放军总医院免疫室

林星石研究员Histroy肿瘤类型：间充质上皮神经外胚层造血源性（1955-1958-1963-1965）Invitro:原代传代建系（1967-1970）配基成分：纯血清含血清无血清生物学特性：细胞亚细胞酶和分子肿瘤细胞invitro的特点细胞保持永生性：自我复制形态学：大小不一?逐渐一致增殖力更强：DNA合成期、分裂期达50%突变性：不同于正常细胞，失去稳定的控制高分化变低分化表面性状：负电荷数量正常，贴壁性?，抗原性可变异接触抑制减弱或消失：悬浮生长特征：成瘤性：移植到动物体内可成瘤肿瘤细胞invitro培基RPMI1640：最常用，+10~20%FCS，上皮性或悬浮性（+0.03%谷氨酰胺）DMEM：常用F12：适用于上皮性癌，如肝癌，L-15：注意：+2g/LNaHco3或+20mmol/LHEPES?pH7.2RPMI1640+F12或L-15（1:1）：适用肉瘤培养液特殊添加剂transferrin5-10?g/mlFGF5ng/ml常用的促细胞生长因子及使用的终浓度BSA10-5mol/mlEGF5ng/ml添加剂终浓度添加剂终浓度氢化可的松10-5mol/mlinsulin5pg/mlNGF5ng/ml肿瘤细胞的培养与常规细胞培养技术相同一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性建株细胞较正常细胞易于培养细胞分裂增殖的调控

（细胞周期）多种基因的协同作用调控因子：基因：Cdc2、cyclin蛋白磷酸化蛋白激酶的调控胸苷激酶的调控负调：DNA损伤与DNA修复：抑制抗性肿瘤细胞细胞间的相互影响不同亚群代表不同分化程度