乙肝病毒核酸扩增荧光检测标准操作程序.docVIP

人乳头瘤病毒基因分型定量检测试剂盒(PCR双色荧光探针法)

检测标准操作规程

1.目的：

保证HPV实时检测及分型试剂盒检测结果的准确、可靠。

2.适用范围：

适用于定量检测生殖泌尿道分泌物、生殖道刮片、组织活检标本等样本受感染细胞中人乳头瘤病毒(HPV)HPV16,18和45型,31型，次要高危型（33，52，58，67型）DNA含量。

3.职责

实验室操作人员应严格按照本规程进行实验，室负责人监督管理。本规程的改动，可由任一使用本规程的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：室负责人、科主任。

4.试剂来源：

意大利人乳头瘤病毒基因分型定量检测试剂盒(PCR双色荧光探针法)；

5.质控物：阴性、阳性对照及阳性参考品系列均来源于试剂合

6．样本的采集，操作，预处理：

6.1细胞样本

细胞学标本包括宫颈取样棒，子宫细胞等。

用宫颈刷或细胞刷取标本，收集到的细胞放入适当的收集液中送检（1XPBS,生理盐水或其他介质）

盛放样本容器可以在2－80C条件下保存，最长可达48h，这期间应进行核苷酸提取。

如不能在短时间里提取样本，标本应在－200C保存。

①细胞样本的前处理

在提取DNA前，如果样品的细胞数太少，应当进行相应的离心来浓缩样本。无菌的PBS可用来作离心标本悬浮液。该步骤可去掉可能存在的粒液细胞或红细胞。

6.2组织标本

组织样本包括新鲜的冷冻的或福尔马林固定的石蜡包埋的活检样品。

新鲜的活检样品须在很短的几分钟内处理或用液氮快速冷冻。并在－800C保存直到用无菌机械捣碎，接着用蛋白酶K消化。

在活检标本被固定和石蜡包埋的情况下，建议用PH为7的含有10%钠盐和钾盐的福尔马林缓冲液，作为清洁液，如组织固定没有采用有上述缓冲液的福尔马林，而是采用Bouin,Holland或其它酸性固定物质的（譬如锇酸）福尔马林液,则该组织标本不适用于DNA的提取，因为这些试剂会导致组织间的相互交联，使组织标本不能被分解。

①组织样本的前处理

在组织样本新鲜或冷冻状态下（多至50mg），用一个无菌的捣碎机快速地将样本机械破碎。在一个玻璃表面里进行操作，然后转移匀桨组织到试管中，接着用蛋白酶K进行消化。

7.标准操作

7.1、DNA提取

7.1.1.阴性质控品处理

a.取50μl阴性质控品加入等量DNA提取液充分混匀，100℃保温10分钟，误差不超过1分钟。

b.12,000rpm离心5分钟，备用。

7.1.2.标本处理

7.1.2.1生殖泌尿道分泌物棉拭子：

a.向玻璃管中加入1ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子。

b.吸取全部液体转至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5分钟。

c.去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml，充分震荡混匀，12,000rpm离心5分钟。

d.去上清，沉淀加入50μlDNA提取液充分混匀，100℃保温10分钟，误差不超过1分钟。

e.12,000rpm离心5分钟，备用。

7.1.2.2生殖道刮片：

a.向玻璃管中加入1ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀。12,000rpm离心5分钟。

b.以下操作同2.1c.d.e

7.1.2.3组织活检标本：

a.用适量灭菌生理盐水洗净送检组织沾带的血液；

b.取约50毫克组织，加1ml灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织匀浆，转移至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5分钟；

c.以下操作同2.1c.d.e。

7.2DNA扩增

7.2.1准备PCR混合液

按如下表准备PCR反应液：

反应1

反应2

反应3

ABRealTimeMix2X

10uL

10uL

10uL

PrimerMix1

0.4uL

ProbeMix1

0.8uL

PrimerMix2

0.4uL

ProbeMix2

0.8uL

PrimerMix3

0.4uL

ProbeMix3

0.4uL

H2O

6.8uL

6.8uL

7.2uL

Volumefinale

18uL

18uL

18uL

每个反应管底部装入18uL的该混合液。

每个反应加2uL提取的DNA或阳性对照DNA。

定性分析：每次实验一个阴性对照组（至少每板每个反应组一管，混合液

以无菌水代替样本DNA），每次实验至少设一个阳性对照（最好同时进行阳性对照）。

定量分析：查看阳性对照标签标识的含量，根据实验量将阳性对照稀释成浓度为100copy的低浓度阳性对照。每次实验的反应1和反应2各设一个阳性对照组（一个阳性对照和一个低浓度阳性对照）。

加入模板后，用防光盖密封并压紧反应管，确保每一管底部不存在气泡，以4000r/min，离心至少2min。如果不能离心，确保移液管将所有的悬浮液转移到反应管底部。