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磷酸西格列汀一水合物中蛋白质总含量检测

摘要：随着环保要求的提升，生物催化代替化学催化法生产原料药的应用越来越广，生物催化法涉及的最大问题是总蛋白质含量残留的检测。通过配制一定浓度范围内的BSA（牛血清白蛋白）标准溶液，测试其吸光度，绘制以浓度-吸光度标准曲线。将待测样品经预处理后，稀释成一定浓度的溶液，也进行吸光度的测试，换算出以BSA标准牛血清蛋白计算的待测样品中的蛋白质总含量。磷酸西格列汀蛋白质总含量残留检测方法的定量限、线性、回收率良好。

关键词：磷酸西格列汀；水合物；蛋白质含量；检测分析

引言：

中国药典2020年版[1]和美国药典中，推荐的蛋白质含量测定法有：凯氏定氮法、LOWRY法、双缩脲法、BCA法、开马斯亮蓝bradford法，紫外可见分光光度法等。本文作者就LOWRY法检测转氨酶法生物催化的磷酸西格列汀一水合物中蛋白质总含量的方法学验证进行阐述。

一、方法原理

碱性条件下，PH=10.0~10.5，蛋白质的肽键和铜离子形成复合物，这时无明显的颜色变化。加入福林酚试剂（主要成分为磷钼酸、磷钨酸），酪蛋白的酚羟基被钨钼酸混合性显色剂还原，生成蓝色的还原产物，还原产物在750nm处有最大吸收波长。通过配制一定浓度范围内的BSA（牛血清白蛋白）标准溶液，测试其吸光度，绘制以浓度-吸光度标准曲线。将待测样品经预处理后，稀释成一定浓度的溶液，也进行吸光度的测试，换算出以BSA标准牛血清蛋白计算的待测样品中的蛋白质总含量。

二、蛋白质总含量限度标准

参照注射用肝素钠中蛋白质总含量的限度标准，肝素钠中蛋白质总含量采取LOWRY法检测，要求≤0.1%，即1000ppm，磷酸西他列汀的剂型为口服片剂，参照注射用药，制定1000ppm的限度标准，也即0.1%。

三、方法描述

溶液配制

硫酸铜试液①

称量约150mg五水硫酸铜和约240mg二水合酒石酸钠到容量瓶中，用水稀释至50ml，混匀。

溶解10g碳酸钠到水中，最终定容至50ml，混匀。

缓慢倾注碳酸钠溶液到硫酸铜溶液中，混匀。

氢氧化钠溶液②

溶解3.2g氢氧化钠至水中，用水稀释至100ml。

去氧胆酸钠试液③

溶解5g去氧胆酸钠到水中，用水稀释至100ml。

碱性铜试液

制备硫酸铜试液①、去氧胆酸钠试液③和氢氧化钠溶液②的混合物，三者的比例为1:2:1。

福林酚试液

混合2ml福林酚试剂和10ml水，室温储存于棕色瓶中。

稀释剂

称取820mg85%的磷酸于100ml的容量瓶中，用纯化水稀释至刻度。

样品溶液

称取约5g磷酸西他列汀一水合物至100ml的容量瓶中，用纯化水至刻度，摇匀，得到浓度为50mg/ml的磷酸西他列汀一水合物溶液。

样品溶液的预处理

移取1ml测样品溶液至2ml的离心管中，加入1ml4%的氢氧化钠溶液，摇匀，密封，在14000r/min的离心机上离心10分钟，吸取上清液0.5ml，放入10ml的离心管，加入纯化水1.5ml。

空白溶液

纯化水

空白溶液的预处理

移取1ml纯化水至2ml的离心管中，加入1ml4%的氢氧化钠溶液，摇匀，密封，在14000r/min的离心机上离心10分钟，吸取上清液0.5ml，放入10ml的离心管，加入纯化水1.5ml。

空白溶液、

样品溶液的检测

预处理后的空白溶液和样品溶液，加入2ml碱性酮试液，混匀，室温静置10分钟。加1ml稀释的福林酚试液，立即混匀，室温静置30分钟。在750nm波长下测定吸光度。注意：孵化期间，在20-30分钟颜色达到最深，之后缓慢变浅。

四、方法学验证可接受标准

项目

可接受标准

定量限

绘制BSA标准曲线，以紫外分光光度计能准确定量的最低浓度作为蛋白质总含量测定的LOQ。

线性

配制1.25~12.5μg/ml的BSA标准溶液，经处理后，在750nm处测其吸光度，以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。观察BSA的线性范围，要求线性相关系数≥0.99。

准确度

标准加入法，一定量的样品溶液，分别加入三个不同浓度水平的BSA标准溶液，经处理后，测其吸光度，扣除样品中总蛋白质的含量，计算回收率。

要求：线性相关系数≥0.99；

回收率：80%~120%；

1、仪器及试剂、样品

仪器列表：电子天平、离心机、紫外分光光度计

试剂清单：牛血清白蛋白、福林酚、去氧胆酸钠、三氯乙酸、氢氧化钠、无水碳酸钠、无水硫酸铜、二水合酒石酸钠、磷酸西他列汀一水合物

2、溶液配制

同三项下“方法描述”中。

（1）稀释剂：称取820mg85%的磷酸于100ml的容量瓶中，用纯化水稀释至刻度。

（2）BSA标准溶液1的配制

配制BSA浓度为1.25μg/ml，2.5μg/ml，3.75μg/ml，6.25μg/ml，10μg/ml，12.5μg/ml，的标准溶液，用稀释剂稀释。

（3）BSA标准溶液2的配制