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3.2缩略语
动物源奇异变形杆菌新德里金属β-内酰胺酶基因blaNDMPCR检测技术规程
1范围
本文件规定了动物源奇异变形杆菌新德里金属β-内酰胺酶基因blaNDMPCR检测技术的术语和定义、检测原理、检测条件、检测方法和结果判定等。
本文件适用于动物源奇异变形杆菌新德里金属β-内酰胺酶基因blaNDM的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括
所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB19489实验室生物安全通用要求
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
以下术语和定义适用于本文件。
3.1.1新德里金属-β-内酰胺酶（NDM）
新德里金属-β-内酰胺酶（NDM）是一种金属-β-内酰胺酶（MBL），能水解大多数β-内酰胺类抗生素（包括碳青霉烯类），但不包括单环内酰胺类（例如氨曲南）。碳青霉烯类抗生素是治疗由大部分革兰氏阴性菌引起的严重感染的主要抗菌药物，临床上可用的β-内酰胺酶抑制剂（包括阿维巴坦、克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦）不能抑制NDM水解活性。NDM-1在2008年首次从一名在印度新德里住院的瑞典患者身上分离出的肺炎克雷伯菌中被发现。目前已在肠杆菌科、不动杆菌和假单胞菌等多个物种中发现了NDM-1，并已鉴定出31种
NDM变体。
3.1.2聚合酶链式反应（PCR）
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，可看作是生物体外的特殊DNA复制，其最大特点是能将微量DNA大幅增加。PCR技术能够检测和鉴别同菌种不同基因型的菌株，跟踪耐药基因的转移和传播，是分子流行病学调查研
究的基础方法。
以下缩略语适用于本文件。
SS：SS琼脂（SalmonellaShigellaAgar）
BHI：脑心浸出液肉汤（BrainHeartInfusionBroth）
Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）
EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）
TBE：Tris-硼酸-EDTA缓冲液
TE：Tris-EDTA缓冲液
4原理
通过对blaNDM基因的序列分析，利用PrimerPremier6.0软件设计并合成了1对特异性引物，建立了动物源奇异变形杆菌新德里金属β-内酰胺酶基因blaNDMPCR检测技术规程。通过反复试验确定引物的最佳退火温度为55℃,该引物具有良好的特异性、稳定性和重复性。用所建立的方法对40株山东地区鸡源奇异变形杆菌中碳青霉烯类耐药基因blaNDM进行检测分析。
5试剂与耗材
5.1美罗培南（MEM）
5.2SS琼脂（按照附录A.1配制）
5.3BHI肉汤（按照附录A.2配制）
5.41mol/LTris-HCl，pH8.0（按照附录A.3配制）
5.50.5mol/LEDTA，pH8.0（按照附录A.4配制）
5.6TE缓冲液（按照附录A.5配制）
5.710×TBE电泳缓冲液（按照附录A.6配制）
5.8琼脂糖凝胶（按照附录A.7配制）
5.92×TaqMasterMix(DyePlμs)
5.10DL2000PlμsDNAMarker
5.11阳性对照
5.12阴性对照
5.13GoldView核酸染料
5.14NDM特异性引物
5.15八连管
5.16离心管（0.2mL、1.5mL）
6仪器与设备
6.1立式高压蒸汽灭菌器
6.2生化恒温培养箱
6.3立式空气恒温振荡培养箱
6.4PCR仪
6.5琼脂糖凝胶电泳仪
6.6凝胶成像系统
6.7微波炉
6.8微量移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL）
6.9冷冻离心机：离心力≥12.000g
6.10水浴锅
6.11电子天平：精度0.1g、0.01g、0.001g
7检测方法
7.1样品准备
将奇异变形杆菌直接划线于SS琼脂平板（含有1μg/mL亚胺培南），37℃孵育16-18h，
选择挑取单个黑色中心菌落接种至含1mLBHI肉汤的1.5mL离心管
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