基因工程3大肠杆菌表达系统.pptVIP

在大肠杆菌细胞不同部位表达外源蛋白质的优缺点表达部位优点缺点细胞质1、形成包涵体1、蛋白质折叠了可能无法恢复起生物学活性（1）蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离2、还原的环境不利于二硫键的形成（2）蛋白质受保护而免受胞内酶的降解（3）蛋白质没有活性，不会使细胞受伤害2、表达的质粒载体构建比较简单周质1、周质中蛋白质种类较少，纯化简单1、信号肽并非总是有助于蛋白质的转运2、蛋白质酶解程度不严重2、有可能形成包涵体3、促进二硫键的形成及蛋白质的折叠4、蛋白质N-末端结构真实胞外1、蛋白质的酶解作用程度很底1、在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白通2、目标蛋白的纯化容易，由于分泌到胞外的常不会分泌到胞外蛋白种类少2、由于分泌到胞外的蛋白质相当于稀释，因3、增进了蛋白质的折叠作用此目标蛋白的得率较低4、蛋白质N-末端结构真实使克隆基因表达的外源蛋白质分泌到胞外的培养基中，是获得蛋白质稳定性的最佳途径。到目前为止，这方面的技术还很不成熟，外泌率低。Talmadge和Gilbert（1982）将外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的不同部位表达。结果：细胞质中表达的大鼠胰岛素原的半衰期仅有2min左右，而表达在大肠杆菌周质中大鼠胰岛素原的半衰期延长了10倍以上。（原因：细胞周质中蛋白酶的含量低）影响因素包括：2、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性当一种克隆的外源基因在大肠杆菌中不能实现其功能表达时，我们往往会认为这是由于转录或翻译过程发生了问题。其实在早期的研究中就有许多实验表明，克隆的外源基因即便是在大肠杆菌中得到了表达，也并不一定就意味着它的多肽产物是稳定的。蛋白质的降解作用在大肠杆菌的细胞中，含有大量的各种类型的蛋白酶，广泛分布在细胞质、周质、内外膜等部位，参与许多方面的代谢活动，包括选择性地酶解异常的蛋白质。已知有许多因素，如不完全多肽、氨基酸取代突变、多酶复合体亚基的超量合成、氧化作用或游离自由基的作用而造成的翻译后损伤，以及基因工程技术的效应等，都可以导致蛋白质分子受损或构型变化，形成异常蛋白质。为了避免在大肠杆菌中发生外源蛋白质的降解，或将此降解作用控制在最低水平，已针对性发展出了许多种不同的技术方案。主要有：1）让外源蛋白质定位在周质或胞外表达；2）使用蛋白酶缺陷的大肠杆菌做表达菌株；3）将转化有克隆基因的寄主菌株放置在低温环境中生长；4）使目标基因以融合蛋白形式表达；5）置换多肽链中某些氨基酸，消除蛋白酶切点；6）对目标蛋白质作疏水性修饰。结构决定因子与蛋白质的稳定性添加标题?与蛋白质稳定性相关的确切的分子结构特征？添加标题?但已经明确了若干种影响蛋白质稳