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对化学性肝损伤有辅助保护作用检验方法

1方案一：四氯化碳肝损伤模型

1.1原理

四氯化碳（CCl4）受到肝微粒体酶活化成为三氯甲烷自由基（CCl3?）与蛋白质共价结合导致蛋白合成障碍、脂质分解代谢紊乱，引起肝细胞内甘油三酯（TG）蓄积。CCl3?也能迅速与O2结合转化为过氧化三氯甲烷自由基（CCl3O2?）导致脂质过氧化，从而引起细胞膜的变性损伤，致使酶渗漏以及各种类型的细胞病变，甚至坏死。

1.2实验动物

成年大鼠或小鼠，单一性别，大鼠（180－220克），每组8－12只，小鼠（18－22克），每组10－15只。

1.3实验方法和步骤

1.3.1剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组、一个空白对照组和一个模型对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组。用CCl4（分析纯）造成肝损伤模型，造模方式可以灌胃或腹腔注射。小鼠CCl4灌胃浓度为1%，以食用植物油稀释，灌胃量5mL/kgBW（折合CCl4的剂量为80mg/kg·BW），大鼠CCl4灌胃浓度为2－3%，灌胃量5mL/kgBW（折合CCl4的剂量为160－240mg/kgBW）。必要时设阳性对照组和溶剂对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。

1.3.2给予受试样品的途径

经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料或饮水亦可，并记录每只动物的饲料摄入量或饮水量。

1.3.3实验步骤

受试组每日经口灌胃给予受试样品，空白对照组和模型对照组给予蒸馏水。将动物每周称重两次，以调整受试样品剂量。于实验第30天将各组动物隔夜禁食16小时，模型组及各样品组一次灌胃给予CCl4，空白对照组给食用植物油，受试组继续给予受试样品至实验结束（与CCl4灌胃间隔4小时以上）。给予CCl4后，根据实际情况于24或48小时处死动物，取血分离血清，测定ALT、AST，并取肝脏进行病理组织学检测。1.3.4检测指标

血清谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶（AST），肝脏病理组织学检查

1.4血清谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶（AST）的测定

1.4.1测定方法：可选用全自动生化分析仪或赖氏法（试剂盒）测定。

1.4.2数据处理和结果判定

采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

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受试样品组的ALT、AST与模型对照组比较，差异有显著性，可分别判定ALT、AST结果阳性。

1.5肝脏病理组织学变化、诊断标准和结果判定

1.5.1实验材料：取大鼠肝脏左叶用10%福尔马林固定，从肝左叶中部做横切面取材，常规病理制片（石蜡包埋，H.E.染色）。

1.5.2镜检：用40倍物镜观察整个组织切片并记录组织的病理变化。可见小叶中心性肝细胞的退行性病变和少数细胞坏死。主要病变类型有肝细胞气球样变、脂肪变性、胞浆凝聚、肝细胞水样变性和细胞坏死等。

1.5.3评分标准：

分别记录每个视野中的各种病变所占视野的面积，并累计所观察视野的病变总分。肝细胞气球样变：（细胞肿大，胞浆残留少许。）

大致正常

0分

气球样变的肝细胞占整个视野的1/4

1分

气球样变的肝细胞占整个视野的1/2

2分

气球样变的肝细胞占整个视野的3/4

3分

气球样变的肝细胞占整个视野

4分

肝细胞脂肪变性：（肝细胞胞浆内出现界限清晰的脂滴空泡。）

大致正常

0分

脂肪变性的肝细胞占整个视野的1/4

1分

脂肪变性的肝细胞占整个视野的1/2

2分

脂肪变性的肝细胞占整个视野的3/4

3分

脂肪变性的肝细胞占整个视野

4分

胞浆凝聚：（胞浆嗜伊红增强）

大致正常

0分

胞浆凝聚的肝细胞占整个视野的1/4

1分

胞浆凝聚的肝细胞占整个视野的2/4

2分

胞浆凝聚的肝细胞占整个视野的3/4

3分

胞浆凝聚的肝细胞弥漫存在占整个视野

4分

水样变性：

未见水样变性的肝细胞

0分

水样变性的肝细胞占整个视野的1/4

1分

水样变性的肝细胞占整个视野的2/4

2分

水样变性的肝细胞占整个视野的3/4

3分

水样变性的肝细胞弥漫性存在占整个视野