鹅星状病毒感染诊断技术规范.docxVIP

DB37/T4459—2021

1

鹅星状病毒感染诊断技术规范

1范围

本文件规定了鹅星状病毒感染的临床诊断和实验室诊断的技术规范。其中临床诊断包括流行病学、临床症状、病理变化；实验室诊断包括样品的采集与保存、病毒分离鉴定、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、实时荧光定量RT-PCR与间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。

本文件适用于鹅星状病毒感染的诊断、检测、监测和流行病学调查。鹅星状病毒感染的流行病学、临床症状、病理变化适用于鹅星状病毒的初步诊断；病毒分离、RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法适用于鹅组织、分泌物、排泄物和病毒培养物中鹅星状病毒分离鉴定及核酸检测；间接ELISA抗体检测方法适用于鹅星状病毒感染的抗体特异性血清学诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489—2008实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

NY/T541—2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

鹅星状病毒感染gooseastrovirusinfection

由鹅星状病毒引起的5日龄～25日龄雏鹅内脏器官与关节发生严重尿酸盐沉积的疾病。

4实验室要求

4.1环境

4.1.1实验室符合GB19489—2008和GB/T27401要求。

4.1.2从事RT-PCR工作的实验室应进行分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电泳检测区，形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。

4.1.3生物样品应严格控制避免对环境造成污染，试验结束后应将相关样品（如血样）进行无害化处

理。

4.2人员

DB37/T4459—2021

2

操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、血清学和分子生物学实验室检测技术培训。熟悉临床诊断、病理组织学诊断、生物样品处理、病毒分离，以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术，熟悉RT-PCR、qRT-PCR与间接ELISA检测结果的判断方法。

5样品

5.1仪器设备

5.1.1生物安全柜。

5.1.2解剖剪。

5.1.3解剖盘。

5.1.4镊子。

5.1.5组织匀浆器。

5.2试剂与材料

5.2.1磷酸盐缓冲液（PBS），见A.1。

5.2.2青霉素（100000IU/mL）。

5.2.3链霉素（100mg/mL）。

5.2.4离心管。

5.2.5样品保存管。

5.2.6滤器（孔径0.22μm）。

5.3样品采集与运送

5.3.1总则：样品采集、保存、运输应按照NY/T541—2016技术规范进行。采样和样品前处理过程中应戴一次性手套、口罩、帽子，采样过程中样品不得交叉污染。

5.3.2组织样品：采集疑似鹅星状病毒感染死亡鹅的肝脏、脾脏和肾脏等组织样品。采集病料时，用无菌手术剪取组织样品，置于样品保存管中，密封、编号。

5.3.3泄殖腔/喉拭子样品：活禽泄殖腔/喉拭子样品，置于样品保存管中。

5.3.4血清样品：用无菌注射器采血1mL，将其注入1.5mL无菌eppendorf管中，于37℃静置2h。分离的血清转入新的无菌eppendorf管中，加盖，编号，待检。采集的血清样品应无溶血，置于离心管中。

5.3.5鹅胚尿囊液：将鹅胚尿囊液加入无菌eppendorf离心管中，加盖，编号，待检。

5.3.6所有样品应置于密闭容器中冷藏运输，保存温度在-15℃以下，时间不超过24h。

5.4样品处理与保存

5.4.1样品应在生物安全柜中进行处理，取10g～20g样品放入灭菌的研钵中磨碎。研磨充分的组织置于含青霉素（2000IU/mL）、链霉素（2mg/mL）、庆大霉素（50μg/mL）和制霉菌素（1000IU/mL）的pH值7.0～7.4的等渗磷酸盐缓冲液（PBS，A.1）中，配制成10%～20%（g/mL）的悬液。样品经10000r/min离心30min，取上清液经0.22μm滤器过滤除菌后，作为接种和检测材料。

5.4.2泄殖腔/咽喉拭子置于含青霉素（2000IU/mL）、链霉素（2mg/mL）、庆大霉素（50μg/mL）