分子生物学实验课件.pptVIP

实验目录;实验一植物基因组DNA提取;4.核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸通常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为DNA和RNA，在真核生物中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质和核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。

5.去除蛋白的方法，通常采用SDS/CTAB等去污剂使蛋白变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取DNA.

6.酚是高效的蛋白质变性剂，氯仿除了进一步去除蛋白，也可以去除残留的酚。

本实验是通过SDS法提取拟南芥基因组DNA。

;SDS是一种阴离子去污剂，能与细胞膜上的蛋白质结合，在65°C高温下能有效裂解细胞膜，使基因组DNA释放出来。

在用SDS-苯酚法提取基因组时，酚能够使SDS-蛋白质复合物中的蛋白质变性，从而使蛋白质和水溶性的DNA分离。

（此法不适用于提取多糖含量较高的植物基因组DNA提取。）;

1.掌握植物基因组DNA分离、纯化原理

2.通过SDS法提取拟南芥基因组DNA。;仪器及耗材：研钵、微量移液器及吸头、EP管、台式离心机。

材料：拟南芥小苗

试剂：DNAExtractBuffer(0.2MNaCl,25mMEDTA,0.5%SDS,pH7.5);70%乙醇；酚；氯仿；异丙醇;RNase

;实验步骤;核酸—DNA和RNA所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具有紫外吸收的特性，它们在260nm处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长进行核酸含量测定。

波长为260nm时，DNA或RNA的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们的不同构型有关。

标样：DNA浓度为1μg/mL时，OD260=0.02

当OD260=1时，双链DNA含量约为50μg/mL

单链DNA含量约为37μg/mL

RNA含量约为40μg/mL

DNA浓度(μg/μL)计算：50×OD260读数

RNA浓度(μg/μL)计算：40×OD260读数

;9;EDTA的作用：抑制内外源DNase的活力。

加螯合剂(EDTA)除去酶的辅因子(Mg2+)，使酶的活性丧失。;实验二PCR克隆目的基因;PCR原理

FLASH演示;TaqDNAPolymerase

1988年Saiki等从水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取耐高温的TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)，此酶在93℃下反应2h后其残留活性是??来的60%。

缺点：

TaqDNAPolymerase只有5’→3’聚合酶活性，但没有3’→5’外切活性，无法消除突变和错配，碱基错误掺入率可达10-4/碱基/循环;PfuDNAPolymerase

PfuDNA聚合酶是已知保真度最高的聚合酶，来自于Pyrococcusfuriosis菌株，不仅具有掺入反应迅速及热稳定性高的优点，更是当前市场上所有DNA聚合酶中掺入出错率最低的一种。

优点：Pfu具有3’→5’校阅功能，其错配率分别仅为10-7。

缺点：效率低，扩增片段较短;TaqPlusDNAPolymerase

是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物，与TaqDNA聚合酶相比，具有扩增长度增加（简单模板可有效扩增20kb,复杂模板可有效扩增10kb),保真度好的特点；与PfuDNA聚合酶相比，具有扩增速度快，反应效率高的优势。;PCR反应体系组成;1.模板;2.引物;引物设计原则;4种dNTP;Mg2+;DNA聚合酶;DNA聚合酶单位定义：1个酶单位是指在74℃下，30min内，使10nmol的dNTP掺入到核酸中所需的酶。

不同公司提供的酶U的定义也不同。;反应缓冲液;缓冲液

10mmol/lTris.Cl

提供适合反应的pH值（pH8.4）

50mmol/lKCl

促进引物退火

10μg/ml明胶或血清白蛋白，二硫苏糖醇

为Taq酶的保护剂，稳定酶的活性;PCR反应主要参数：

1.预变性：94°C，3--5min

2.变性：94°C，30s-1min

3.复性：56°C，20s--2min

4.延伸：72°C，30s--3min

5.总延伸：72°C，10min;