第七讲核酶完整版本.pptVIP

核酶（Ribozyme)一、概述二、剪接型核酶三、剪切型核酶四、核酶的应用五、核酶技术面临的问题六、脱氧核酶（deoxyribozyme)并于1985年证明其内含子L-19IVS（interveningsequencelacking19nucleotides)在体外能高度特异地催化寡聚核糖核苷酸底物的切割和连接，具有RNA酶与RNA聚合酶活性。1990年发现了以DNA为底物的核酶。1994年发现了脱氧核酶，是一类具有催化活性的DNA小分子。1997年Zhang和Cech通过人造RNA分子证明RNA分子具有肽基转移酶活性。近年的体外研究表明，第Ⅱ类内含子RNA可以催化加入核苷酸的RNA编辑过程.蛋白质结构中不同类型氨基酸的支链之间可以发生复杂的相互作用，而蛋白质主链本身不是很灵活，具有一定的刚性。因此，很少的几个氨基酸就可以形成1个蛋白质酶的三维结构，而且其活性中心具有很强的刚性。而由4种核苷酸组成的核酶则不具有蛋白质酶的这些特性。科学研究表明：核酶需要较大的结构才能提供较稳定的活性中心，从而有效地提高反应速度；而小的核酶结构只勉强可以满足催化反应的需要。最小的天然核酶---锺头核酶的基本结构也不少于30个核苷酸。核酶和蛋白质酶在反应机制上的比较核酶也采用普通酸碱催化的反应机制催化磷酸酯键的水解，但其活性中心却是二价的金属离子。（因核苷酸的pKa通常离生理pH较远，无法成为亲核反应的催化中心）。在某些蛋白质酶催化的反应中，反应是通过酶支链上的活性功能团与反应底物瞬时形成共价键形式的活泼中间过渡态（如希夫碱）而进行的。共价中间过渡态的形成可以使一个本来需要很高活化能的反应分解成两步或多步各需较小活化能的反应。共价催化可以分为三类：第一类，亲核基与最终的受体的反应性相似；第二类，亲核基较最终的受体活泼的多；第三类，底物与亲核基形成共价加成物会增加底物的反应活性，从而加速反应的进行。但至目前为至，还末发现采用第二和第三类共价催化方式的核酶。蛋白质酶催化反应的另一个特点是用辅助因子调节和控制反应的进行。目前还末发现天然核酶利用辅助因子调节和控制反应，但已发现有些人工筛选的核酶利用辅助因子，如ATP等调控反应。至今为止的研究结果表明：蛋白质酶比核酶能更有效地利用辅助因子调控催化反应。利用内在结合能进行催化反应是所有生物催化反应的共同特点。蛋白质酶利用结合能将反应底物准确地固定在反应中心，核酶也一样，但其效率远低于蛋白质酶。这是因为底物的固定需要一个刚性的接合部位，而与蛋白质酶相比，RNA的立体结构难以形成一个刚性的结构。二、剪接型核酶剪接型核酶的作用机制是通过既剪有接的方式除去内含子（Intron).剪接型核酶分类1、I类内含子2、II类内含子1.I类内含子的自我剪接(Self-splicing)剪接机制L-19IVS在体外的多种酶活性核酶是一种金属依赖酶结构与功能的关系I型内含子核酶所催化的典型反应是包括两步磷酸酯键转移反应的RNA剪接反应．在这个反应中需要镁离子、外源鸟苷或其磷酸化衍生物(GMP、GDP、GTP)．首先，一个外源鸟苷的3羟基攻击5’剪接位点的磷原子，并与内含子5’的第一个核苷酸形成3，5磷酸二酯键；然后，5外显子的3羟基攻击3剪接位点的磷原子，导致内含子的释放和外显子的连接剪接反应释放出5端连有外源G的内含子是I型内含子自剪接反应的显著特征．在剪接反应完成之后，许多内含子还会催化自身的环化反应天然四膜虫内含子核酶所催化的自剪接反应和环化反应均属分子内转酯反应核酶是一种金属依赖酶金属离子的作用：1.特异的结构作用，或参与活性部位的化学过程2.促进RNA的总体折叠3.二价金属离子（如Mg2+）与底物活性部位直接相互作用，参与过渡中间复合物的形成镁离子等二价金属离子被证明直接参与I型内含子核酶的催化反应，是核酶催化核心的组分之一值得注意的是，并不是所有稳定的三级结构都具有催化活性，研究发现镁离子和其他一些阳离子也可以稳定I型内含子核酶RNA的错误构象，从而影响其催化活性.含有10个结构相似的双螺旋区域引导序列：IVS中的6个嘌呤核苷酸序列5‘CUCUCU3’3’GGGAGG5’G结合位点:IVS中的P7茎区在不同的I型内含子里，保守的配对区之间常会有额外的配对区，这些配对区按照其上游的保守配对区可以依次命名为Pm．1，Pm．2等等对催化活性很重要的P3与P7是两个远程配对区，它们的两条配对链从核苷酸序列来看相隔很远，Tetrahymena核酶折叠动力学的研究表明，P3与P7的形成是整