引物设计流程.pptVIP

实时荧光定量PCR引物设计及相关软件使用主要内容1.背景2.引物设计原则3.常用引物设计软件4.PrimerPremier5和Oligo6介绍5.引物BLAST一、背景■实时荧光定量PCR是通过实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法，它是在PCR反应体系中加入荧光物质并通过real-timePCR检测系统对PCR产物反应进程中的荧光信号进行实时监测，最终对实验数据进行分析处理的方法。■引物是该技术中至关重要的一环。使用不合适的引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的条带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱等。引物可以通过参考文献获得，也可以进行自己设计，无论哪种方式引物都是要通过计算机软件进行检验。引物的设计原则可以根据实际需求自己灵活把握。三、常用的引物设计软件PrimerPremier5（自动有哪些信誉好的足球投注网站）*Oligo6（引物评价）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在线服务）四、PrimerPremier5和Oligo6介绍PrimerPremier5在引物有哪些信誉好的足球投注网站上较Oligo6有优势，并可以对引物序列进行综合评分。Oligo6在引物结构分析上有比PrimerPremier5强大的功能。所以，设计引物的时候我们可以将两个软件结合起来。■软件使用前的准备工作1、下载并安装PrimerPremier5和Oligo6。2.进入NCBI的基因库查找所需的基因序列。序列的查找方法PrimerPremier5引物有哪些信誉好的足球投注网站选择序列基本信息引物设计界面引物有哪些信誉好的足球投注网站选项设定有哪些信誉好的足球投注网站结果引物信息保存引物信息Oligo6引物结构分析3个弹出窗口用Oligo人工设计引物时的3个特点Tm值曲线以选取5’到3’的下降形状有利于引物引发聚合反应。Frq曲线宜选用3’端Frq值相对较低的片段。ΔG值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低选中引物引物结构分析引物筛结构分析条件

1.KeyInformation：3，端得△G≤9kcal/mol。Tm尽量一致，最好控制在55℃～60℃。

2.DuplexFormation：≤3base，△G≤4.5kcal/mol。

3.HairpinFormation：≤3base，△G≤4.5kcal/mol。

4.GC%：GC含量在40～60%之间，两条引物最好保持一致。

5.Falseprimingsites：要使错误引发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。最终PCR信息五、引物BLAST判断一个引物是否合适最重要的一步就是比对，如果你所设计的的引物通过比对不能返回到你设计引物的源基因，那么你的引物就是不合格的，即使你设计出来的引物其余的条件都符合，必须放弃。1.进入BLAST界面2、输入引物对比对条件设置3、比对结果谢谢！引物对要从5，端到3，端输入，上游引物和下游间输入20以上n→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer二、引物设计原则■PrimerPremier5主要功能：1、引物自动有哪些信誉好的足球投注网站和设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析Oligo6主要功能：引物设计与分析■PrimerPremier5和Oligo6比较CDS是编码序列，所以一般选择此序列作为设计的基因源序列给出的基因序列为全序列，设计引物只要CDS中的序列PreimerPremier启动界面序列名称源序列只能用ctrl+v才能输入目的序列输入序列上游和下游链引物信息栏引物类型有哪些信誉好的足球投注网站模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer保存时要安装一个虚拟打印机一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏都没有出现红色，而且评分较高，Tm值55-60℃之间。但是往往有时候达不到那么严格的要求，因此我们可以适当放宽要求，但是二聚体和发夹结构是不能有的，Tm值也不能相差超过2℃。打开新序列ctrl+v输入序列Meltingtemperature?GInternalStabilityFrq为邻