详解鸭坦布苏病毒NS1蛋白.pdfVIP

摘要/Abstract

[目的]

利用原核表达系统制备鸭坦布苏病毒（duckTembusuvirus，

DTMUV）NS1蛋白及其多克隆抗体。

[方法]

利用PCR与核苷酸序列测定方法克隆DTMUVNS1基因，连接至

重组表达载体pET-30a（+），构建重组质粒pET-NS1，转化至大肠杆

菌Rosetta（DE3）感受态细胞，SDS和Westernblot进行IPTG

诱导表达产物分析与鉴定，从IPTG的浓度和诱导时间进行表达条件

优化，并进行表达产物可溶性分析，重组DTMUVNS1蛋白经亲和层

析纯化后免疫小鼠，制备鼠抗DTMUVNS1蛋白多克隆抗体，并通过

间接免疫荧光试验（IFA）鉴定。

[结果]

成功克隆DTMUVNS1基因，约1065bp，获得重组质粒pET-NS1，

转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）后，可见分子质量约43ku的特异

蛋白，可以与鸡抗DTMUV多克隆抗体发生免疫反应，终浓度为0.8

mmol/L的IPTG诱导2～5h为DTMUVNS1蛋白最佳表达条件，呈

包涵体形式表达，经亲和层析纯化后，成功获得分子质量约43ku的

NS1蛋白，蛋白质量浓度为329μg/mL，鼠抗DTMUVNS1蛋白多克

隆抗体可以与DTMUV发生特异性免疫反应。

[结论]

本研究利用原核表达系统表达和纯化DTMUVNS1蛋白，并制备

鼠抗DTMUVNS1蛋白多克隆抗体，可为DTMUV致病机制研究和免疫

学检测方法建立提供物质材料与技术指导。

研究背景

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（duckTembusuvirus，DTMUV）

引起主要侵害水禽的一种病毒性传染病。2010年，我国南方地区首

次发现该病，并很快在鸭主要养殖地区广泛流行，造成巨大经济损失。

DTMUV可感染雏鸭与成年鸭，主要表现为神经症状与蛋鸭产蛋量急剧

下降，病理变化以脑膜炎与卵泡变性、萎缩及卵黄性腹膜炎为特征。

此外，有研究发现，DTMUV可以在多种哺乳动物细胞上进行繁殖，并

且可以经脑内注射引起小鼠全身性组织感染，Tang等发现，山东某

鸭场饲养员血液中DTMUV抗体阳性率达70%以上。因此，对于该病的

研究与防控还具有重要的公共卫生学意义。

DTMUV属于黄病毒科、黄病毒属成员，其基因组为RNA，约10990

bp，仅有1个开放阅读框，编码的多聚蛋白前体经宿主信号肽酶和

病毒的丝氨酸蛋白酶裂解为3种结构蛋白（即C、M和E蛋白）和7

种非结构蛋白（即NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白）。

NS1蛋白是由352个氨基酸组成，分子质量约40ku。已有报道证实，

NS1蛋白是与细胞膜功能密切相关的一种糖蛋白，与DTMUV在宿主细

胞内的复制、病毒毒力和免疫逃避等方面发挥重要作用。本研究利用

原核表达系统表达DTMUV的NS1蛋白，经纯化后免疫小鼠，制备鼠

抗NS1蛋白多克隆抗体，为研制DTMUV的亚单位疫苗、致病机制研

究及免疫学检测方法建立提供物质基础。

研究结果

1.DTMUVNS1基因克隆

以DTMUV弱毒疫苗株为模板，DTMUV-NS1-S和DTMUV-NS1-A为

引物，RT-PCR扩增产物经琼脂糖核酸电泳结果显示，PCR扩增产物

在约1065bp位置出现特异条带，与预计相符（图1A）。NS1基因

连接至pMD-18T载体，构建的重组质粒pMD-NS1经限制性内切酶Sal

I、SalI/XhoI双酶切后，均出现约2700和1065bp2条带，

结果与预期相符（图1B），证实重组质粒pMD-NS1构建成功。核苷

酸测序与分析结果证实，本研究成功克隆DTMUVNS1基因，为106