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定点突变试剂盒

定点突变试剂盒

概述：

定点突变试剂盒可以在克隆于质粒DNA序列的特定位点诱导突变。理论上可以保证突变率到达100%。整个实验过程简单快捷只需要两个步骤。试剂盒不需要用到M13载体和甲基化步骤。该试剂盒可以诱导某个基因的特定碱基进行定点突变、再突变成野生型、密码子突变、插入或者缺失等，因此可以用于功能基因组学和蛋白质组学的研究。另外由于试剂盒能够诱导特异基因突变，又可以应用于蛋白质工程学研究领域。定点突变试剂盒操作十分简单〔根据我们提供的引物设计原那么设计引物；用Muta-directTM酶进行15~18个循环的PCR扩增反响；MutazymeTM酶处理选择突变克隆；转化〕。理论上在LB平板上的克隆100%是突变克隆，通过对突变克隆的测序分析，正确的突变可以应用于后续实验。

目录号

规格

价格

SDM-15

15次

950元

产品特点:

????操作简便，无需特殊的实验技能

????2~3天即可完成基因的定点突变

????整个实验过程只需要用到两种酶:Muta-directTM????酶和MutazymeTM酶

????使用范围广泛：可以用于点突变〔Pointmutation〕、缺失突变〔Deletion〕和插入突变〔Insertion〕等

100%的突变效率?

贮存条件:

????请将试剂盒中提供的各种试剂贮存于-20℃。由于试剂盒中提供的反响缓冲液及dNTP是为反响专门优化的，所以不要用其它的反响缓冲液及dNTP代替。

试剂盒组成：

????试剂盒提供的对照模板及引物，可以完成5次对照实验。包括对照反响在内，本试剂盒共可进行10815次基因定点突变反响〔每次反响体系50μl〕。

组成

次量

Muta-DirectTMEnzyme(2.5U/μl)

15μl

Muta-DirectTMReactionBuffer(10×)

100μl

dNTPMixture

30μl

pUC18ControlPlasmid(10ng/μl)

10μl

ControlPrimerMix(20pmol/μl)

10μl

Competentcells

Notprovided

定点突变对照实验：

????试剂盒中提供的对照质粒为pUC18，通过它可以判断实验的成功与否。pUC18质粒包含LacZ基因，用试剂盒中提供的对照引物可以诱导pUC18中丝氨酸〔TCG〕突变为终止密码子〔TAG〕，这样会导致LacZ基因失活，因此LB平板上的克隆必须都为白色才证明突变成功。对于首次做突变实验的用户，可以通过对照反响观察实验是否成功。

引物设计：

????首先需要进行引物设计，设计时请参考如下原那么:

????通常引物长度为25~45mer，我们建议引物长度为30~35mer。

????注：突变位点应该设计在引物的中央位置。

????如果设定的引物长度为30mer，接下来需要计算引物的Tm值，看是否到达78℃〔GC含量应大于40%〕。

????如果Tm值低于78℃，那么适当改变引物的长度以使其Tm值到达78℃〔GC含量应大于40%〕。

????????①设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。

????????②计算引物的Tm值，看是否到达78℃，如果Tm值低于78℃，那么适当改变引物的长度以使其Tm值到达78℃〔GC含量应大于40%〕。

????????③最好使用经过纯化的引物。Tm值计算公式：Tm=0.41×(%ofGC)-675/L+81.5

????????注：L：引物碱基数；%ofGC：引物GC含量。

引物设计实例：

????以GCG→ACG为例：

????5-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3

????①首先设计30mer长的上下游引物，并将A(T)设计在引物的中央位置。

????Primer#1:5-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’

????Primer#2:5-GCAATAAGTAAGTCGTCTAATACTGAAGG-3

????②引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5〔Tm=0.41×40-675/30+81.5〕。通过计算可以看出其Tm低于78℃，这样的引物是不适宜的，所以必须调整引物长度。

????③重新调整引物长度。

????Primer#1:5-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3

????Primer#2:5CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3

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